A citometria de fluxo de microfluido, combinando a tecnologia de microfluido com a citometria de fluxo, alcançou uma alta integração da seleção celular e da função de análise downstream, com os seguintes princípios básicos e métodos de implementação:
Princípio básico: Manipulação precisa em microescala
A citometria de fluxo de microfluido utiliza canais de microns (1-1000 μm) para alcançar a manipulação precisa do fluido, combinando a capacidade de detecção e seleção de fluorescência da citometria de fluxo para formar um processo integrado de "detecção - seleção - análise". Suas principais tecnologias incluem:
Controle do fluxo stratificado: o fluido dentro do microcanal está em estado stratificado (número de Reynolds Re<1), e a trajetória do movimento celular é estável e previsível, evitando interferências turbulentas nos métodos tradicionais.
Classificação de Ativação de Fluorescença (FACS): através da marcação fluorescente de antígenos da superfície celular ou substâncias internas, a luz dispersa e sinais fluorescentes são gerados após a excitação do laser, convertidos em sinais elétricos através de fotomultiplicadores e identificados pelas células alvo após o processamento por computador.
Mecanismo de Classificação Física: Utilizando propriedades físicas como tamanho celular, densidade e elasticidade, a classificação sem marcas é realizada por meio de técnicas como matrizes de microcolunas, foco de inércia e ondas de superfície sonora (SAW).
Integração funcional: todo o processo da seleção à análise
Pré-processamento e amostragem de amostras
O chip de microfluido integra módulos funcionais de filtragem e diluição de amostras, e a suspensão celular forma uma única coluna depois de ser envolta através do fluxo de cápsula para entrar na área de detecção por meio de alta tensão ou acionamento elétrico.
Detecção e classificação de alto fluxo
Detecção de fluorescência: o feixe laser irradia verticalmente o fluxo celular, a luz dispersa reflete o volume celular e a intensidade do sinal fluorescente representa a concentração de antígeno ou substância no núcleo.
Execução de seleção: de acordo com os resultados do teste, o fluxo celular é controlado por meio de campos elétricos, pinças fotográficas, microválvulas PDMS ou válvulas de mudança de fase. Por exemplo, a comutação de campo elétrico pode desviar as células carregadas para diferentes piscinas de coleta; A tecnologia de pincel permite um posicionamento preciso a nível de mícrons através da captura e do movimento a laser.
Integração de análise downstream
Análise de morfologia em tempo real: módulo de imagem de alta velocidade integrado para capturar em tempo real a morfologia celular, brilho, tamanho e outros parâmetros, combinando sinais fluorescentes para análise multidimensional.
Operação fechada: a amostra é fechada durante todo o processo, desde a amostragem até a análise, reduzindo a poluição e os erros operacionais e aumentando a confiabilidade dos dados.
Vantagens técnicas: eficiência, precisão e baixo custo
Processamento de alto fluxo: o design de canal paralelo em matriz suporta o processamento de mais de 50 amostras por hora, com 106 células classificadas em apenas 10 minutos.
Alta pureza e taxa de recuperação: pureza de separação de 95% -99,9%, taxa de recuperação superior a 90%, retenção de atividade celular superior a 95%.
Baixo custo e facilidade de uso: a produção em massa de chips reduz o custo de separação única (1/5-1/10 dos métodos tradicionais), a operação automatizada reduz os erros manuais e é adequada para a preparação de células de nível industrial.
IV. Aplicações
Detecção de células tumorais circulantes (CTCs): classificação de CTCs com diâmetro de 20 μm com pureza superior a 99% pela tecnologia DLD.
Tratamento de células imunológicas: selecionar células T CD8+ altamente ativas para encurtar o ciclo de amplificação de 2-3 dias e reduzir o custo da cultura.
Pesquisa de células tronco: processar de forma eficiente amostras de microbiópsia para evitar falhas experimentais devido a um volume de amostra insuficiente.