O analisador de estabilidade da proteína PSA-16 ajudou os pesquisadores do Laboratório Nacional de Engenharia Local Conjunta de Tecnologia de Desenvolvimento de Medicamentos de Anticorpos da Universidade de Henan a publicar o artigo "Atenuação de lesão de isquemia cardíaca / reperfusão através do receptor de engano DcR2 por alvejar o domínio PLAD do receptor de morte DR5" no International Journal of Biological Macromolecules em março de 2025.

O objetivo deste estudo é identificar os alvos de ação de DcR2 e explorar o mecanismo de proteção do músculo cardíaco de DcR2 em danos I / R do músculo cardíaco de ratos. Os resultados mostraram que a proteína de fusão hDcR2-Fc tem um efeito protetor significativo contra isquemia cardíaca / danos de refusion. O DcR2 forma um complexo heterogêneo com o DR5 através de seu domínio PLAD, que não possui um domínio de morte completo e, portanto, não pode transmitir sinais a jusante. Além disso, a formação do complexo esconde os locais que interagem com o ligando TRAIL, reduzindo assim a morte de células do músculo cardíaco após lesões isquémicas / refusionais. Assim, este estudo revelou que o domínio PLAD do DcR2 desempenha um papel fundamental na inibição da apoptose celular, fornecendo alvos potenciais para o desenvolvimento de novos medicamentos.

Lijie Zhang, Xinyuan Zhang, Ziting Li, Tingting Mo, Querendo Feng, JingLun Zhang, Dan Zhao, Ying Wang, Yinxiang Wei, Yaohui Wang

Laboratório Nacional Conjunto para Engenharia de Medicamentos de Anticorpos, o Primeiro Hospital Afiliado, Universidade de Henan, Kaifeng, China

Faculdade de Medicina, Universidade de Henan, Kaifeng, China

Laboratório Nacional Conjunto para Engenharia de Medicamentos de Anticorpos, Universidade de Henan, Kaifeng, China

Zhou, D. et al.

A estabilidade térmica da proteína refere-se à capacidade de deformação da cadeia de polipéptidos da proteína sob o efeito da temperatura, principalmente refletida nas mudanças nas propriedades químicas da cadeia de polipéptidos e na configuração espacial quando a temperatura muda, quanto menor a mudança, maior a estabilidade térmica. A estabilidade térmica das proteínas é afetada por diferentes temperaturas, pH, intensidade iónica e outros fatores externos, que são importantes em áreas como biotecnologia, desenvolvimento de medicamentos e indústria alimentar.

Temperatura de degeneração da proteína é um conceito importante para os biólogos estudar a estabilidade térmica da proteína, refere-se ao ponto de temperatura em que a proteína é submetida ao efeito térmico em condições de temperatura específicas, sua estrutura muda, quando a temperatura é geralmente mais alta, a proteína muda de uma estrutura tridimensional estável para uma estrutura desordenada solta. A estabilidade térmica das proteínas é geralmente expressa pela temperatura do ponto médio de degeneração térmica (Tm), ou seja, a temperatura em que a proteína é dobrada em 50%.

01 Preface

A morte de células do músculo cardíaco causada pela deficiência de oxigênio isquémico é a principal causa de danos do músculo cardíaco. O DcR2 é o receptor de atração do TRAIL, e o papel do DcR2 na lesão de isquemia miocárdica / re-perfusão (I / R) é desconhecido. Pesquisas recentes mostraram que o DcR2 não só se liga ao TRAIL como receptor, mas também como ligante do DR5 para bloquear a apoptose induzida pelo TRAIL in vitro, mas a preferência de afinidade do DcR2 para o TRAIL ou o DR5 em vivo ainda não é clara. Pesquisas anteriores descobriram que a proteína de fusão hDcR2-Fc desempenha um papel protetor cardíaco em modelos de danos I / R do músculo cardíaco de camundongo, alcançado através da redução da apoptose celular. Determinações de afinidade mostraram que DcR2 tem maior afinidade com DR5 do que com TRAIL e que DcR2 é mais propenso a se ligar a DR5. Estudos mecânicos mostraram que a ausência de PLAD elimina o efeito protetor do hDcR2-Fc contra lesões cardiomusculares causadas por I/R. DcR2 forma um complexo heterogêneo através de um domínio PLAD semelhante ao DR5. Em resumo, este estudo revelou que o DcR2 pode direcionar DR5 através do domínio PLAD para formar um complexo heterogêneo, bloqueando a apoptose celular, melhorando a lesão I / R do miocardio e fornecendo novas estratégias de prevenção para o tratamento de lesões I / R do miocardio.

02 Resumo

O infarto miocárdico agudo (IMA) é uma doença que ameaça gravemente a saúde humana e a mortalidade por IMA continua a ser alta em todo o mundo. A morte de células do músculo cardíaco causada por hipooxigênio isquémico é uma lesão irreversível. O tratamento de intervenção coronária transcutânea (PCI) pode ser eficaz para reduzir a mortalidade em pacientes com infarto miocárdico agudo, mas há dois grandes desafios: o curto tempo de ouro para o tratamento e a lesão isquémica / re-perfusão (I / R). Além disso, a incidência de insuficiência cardíaca de longo prazo também é alta. Para reduzir o alcance do infarto miocárdico, prolongar o "período de janela" da morte de células miocárdicas e melhorar o pronóstico a longo prazo do paciente, é necessário desenvolver novos tratamentos que possam reduzir ou reverter a lesão cardíaca.

O infarto miocárdico é frequentemente acompanhado de várias alterações patológicas, a mais grave delas é a apoptose miocárdica. No entanto, não há estratégias clínicamente eficazes para tratar a apoptose cardíaca. Portanto, a busca de alvos-chave para prevenir a apoptose miocárdica pode fornecer novas estratégias para a prevenção e o tratamento do infarto miocárdico. O ligante indutor da apoptose associado ao fator de necrose tumoral (TNF) (TRAIL), também conhecido como ligante Apo2, pertence à superfamilia de ligantes TNF. Até agora, cinco receptores TRAIL foram identificados em humanos. Os receptores DR4 (TRAIL-R1) e DR5 (TRAIL-R2), conhecidos como receptores de morte (DRs), possuem um domínio de morte completo (DD) capaz de transmitir sinais de morte regulados pelo TRAIL. Os DRs mediam a ativação das vias de sinalização associadas a jusante, resultando em apoptose celular, onde o DR5 é o principal receptor de morte.AutorEstudos anteriores confirmaram que a proteína de fusão sDR5-Fc bloqueia especificamente a via TRAIL-DR5, melhorando assim a função cardíaca após infarto de miocardio em macacos, suínos e ratos.

03 resultados

Para determinar se o PLAD está mediando a ligação de DcR2 a DR5,AutorA proteína de fusão DcR2ΔPLAD-Fc com o domínio PLAD ausente foi preparada. A remoção do domínio PLAD não afetou a estrutura secundária do DcR2, mas sua temperatura de fusão (Tm) caiu ligeiramente, indicando que sua estabilidade foi enfraquecida. A afinidade de DcR2APLAD-Fc com TRAIL foi então determinada como 4,724 x 10-7 M, ligeiramente inferior ao tipo selvagem. Os resultados do experimento de bloqueio da apoptose sugerem que DcR2 não pode bloquear a apoptose após a remoção do domínio PLAD, o que confirma a importância do domínio PLAD.

A análise da estabilidade térmica de NiV G-ferritina e NiV sG foi realizada por meio de fluorimetria de varredura diferencial (DSF) usando o analisador de estabilidade da proteína PSA-16, mostrando que NiV G-ferritina e NiV sG mostraram estabilidade térmica semelhante, com Tm de ~ 65 ° C, indicando que a fusão de NiV G e ferritina não afetou significativamente sua estabilidade estrutural.

Como o NiV G-ferritina pode induzir* uma resposta imunológica líquida corporal, os pesquisadores também selecionaram ratos imunes ao NiV G-ferritina para preparar um lote de anticorpos monoclonais (mAb). Dos 27 mAbs isolados, 25 mAbs foram eficazes na inibição da infecção pelo falsovírus NiV, que é o esqueleto do vírus da bucite vesicular (VSV), com uma concentração (IC50) inferior a 10 ng/mL necessária para inibir 50% da infecção pelo falsovírus NiV. A análise de competição epitópica descobriu que os 27 mAbs selecionados identificaram quatro epitopos diferentes de antígeno na proteína NiV G, incluindo dois novos epitopos não relatados anteriormente. Finalmente, os pesquisadores avaliaram a resposta imunológica e os efeitos protetores induzidos pela G-ferritina do NiV em um modelo letal de infecção pelo vírus Nipa (hamster dourado sírio). Os estudos descobriram que após administrar duas ou três agulhas de NiV G-ferritina aos hámsteres, os hámsteres produziram soro médio e ativo, e que a vacinação duas ou três vezes ajudou os hámsteres a resistir 100% aos ataques da dose letal de NiV. Os pesquisadores testaram ainda o conteúdo de RNA viral em três doses de hamsters vacinados e descobriram que nenhum RNA viral foi detectado nos pulmões, cérebro e baço dos hamsters, sugerindo que três doses de NiV G-ferritina inibiram a replicação do vírus nos pulmões, cérebro e baço dos hamsters.

04 Metodologia

Fluorescença de varredura diferencial

A estabilidade térmica da proteína alvo foi determinada por fluorometria de varredura diferencial (DSF) usando o instrumento PSA-16 (Beijing Buster Technology Co., Ltd.). Diluir a amostra a 0,5 mg / mL e carregar a amostra diluída de 20 μL em um tubo de vidro de quartzo. Medir dinamicamente em tempo real a intensidade de fluorescência (F) de 330nm e 350nm da proteína alvo sob excitação UV de 280nm usando varredura de temperatura linear de 23 a 97 ° C a velocidades de aquecimento de 1 ° C / min. Calcule o ponto médio de transição térmica (Tm) com base na inclinação da curva F350nm/F330nm. Cada amostra foi medida em paralelo quatro vezes.

Dispersião cromatográfica de exclusão de tamanho de partículas por acoplamento óptico multiangular (SEC-MALS)

Um volume de 100 μL por amostra (NiV g-Ferroproteína 0,5 mg/mL, 2 mg/mL) mL (NiV sG) foi injetado na coluna cromatográfica WTC-030S5 (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, EUA) com 0,5 mL/min de operação isotérmica com 20mMTris-HClpH8.0 e 150mmnacl como fases móveis. Um Detector MALS (DAWN) ®) Conecte em série um detector de refração (RI) (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, EUA) ao detector de raios ultravioletas do sistema SEC. Proteína sérica bovina (BSA usando Scientific) para o tratamento normalizado do detector de dispersão de luz estática. Dispersião de luz, medição da diferença de refração (dRI), e moléculas usando o software ASTRA (6.1.2.84) (Wyatt Technology).

Ensaio de imunoassorção enzimática (ELISA)

Detectar a resistência à NiV g-ferroproteína com ELISA. Simplificando, 96 - tampão revestido com 3 μg / mL de NiV a 4 ° C por uma placa ELISA (Corning) durante a noite sG ou NiV g - ferroína (0,1 mcarbonate, pH 9,6). Após quatro lavagem 1 vez com PBS-T (pbs contendo 0,05% Tween 20), todos os buracos foram bloqueados com 50 μL de tampão de bloqueio (1% BSA em PBS-T) a 37 ° C para 2 h. Após o bloqueio, NiV G mono-anti-HENV-32, HENV-26, nAH1.3, anti-raiva Virus mono-anti-RVC20 (controle negativo) foi diluído sequencialmente a partir de 5 μg / mL Adicionar a placa, incubar 2 h PBS-T para lavar 4 vezes a 37 ° C e, em seguida, adicionar anticorpo anti-humano de cabra ligado a HRP IgG (1: 20.000 diluído, clone ab, AS002) para preservar 1 h a 37 ° C. O prato foi lavado com 50 μL / buraco mono-componente TMB colorante solução (NCMBiotech) para preservar por 10-30 minutos a 37 ° C. Reação do Substrato Adicionar HCl 1M em 50 μL/poço com absorção fotográfica medida a 450 nm (OD450). Para o teste de titração de ligação sérica,Autor aprovadoA cabeça G de NiV-M, NiV-B e NiV-B encapsula HeV, LayV e MojV em placas de ELISA, acopladas a HRP usando IgG anti-ratos de cabra (1:8000 diluído, clonado ab, AS003)。

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05 Resumo

Em conjunto, o estudo projetou com sucesso uma nova vacina candidata a nanopartículas com o domínio da cabeça da proteína NiV G como alvo de antígeno, com a ferritina como plataforma de demonstração e isolou um lote de anticorpos monoclonais com efeitos terapêuticos potenciais. O estudo fornece novas informações para uma compreensão aprofundada da imunogenicidade da proteína G do NiV, e espera-se que a NiV G-ferritina seja desenvolvida ainda mais como uma vacina candidata de amplo espectro para o Hennipa, fornecendo novas estratégias de proteção para a segurança da saúde pública em todo o mundo.

Zhao Haiyang, pesquisador do Laboratório Nacional de Virologia da Universidade de Wuhan, e Deng Zhangxin, pesquisador do Instituto de Virus de Wuhan da Academia de Ciências da China, são os coautores do artigo. Zhou Dan, um estudante de pós-graduação da Faculdade de Ciências da Vida da Universidade de Wuhan, Zhou Yangfeng, um estudante de pós-graduação de mestrado e o Dr. Yao Yangfeng, um experimentador sênior do Instituto de Pesquisa de Vírus de Wuhan da Academia de Ciências da China, são os co-primeiros autores da tese.

O estudo foi financiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento, pelo Programa de Talentos Jovens do Conselho de Saúde da Província de Hubei e pelo Programa de Talentos Acadêmicos da Academia de Ciências da China, com o apoio do Laboratório Nacional de Biosegurança de Wuhan e do Laboratório Nacional de Virologia de Wuhan.

Link original: https://www.nature.com/articles/s41541-024-00954-5

Os autores usaram o analisador de estabilidade da proteína PSA-16 independentemente desenvolvido pela Beijing Buster Technology Co., Ltd., através do princípio da fluorometria de varredura diferencial (DSF) para a análise de estabilidade térmica da NiV G-ferritina e NiV sG, os resultados mostraram que a NiV G-ferritina e NiV sG mostraram estabilidade térmica semelhante, Tm de ~ 65 ° C, indicando que a fusão de NiV G e ferritina não teve um efeito significativo sobre sua estabilidade estrutural.