Pesquisadores do Laboratório Nacional de Virologia da Universidade de Wuhan publicaram um artigo em agosto de 2024 na revista Nature, npj Vaccines, intitulado "Uma nanopartícula de glicoproteína de anexo elicita anticorpos amplamente neutralizantes e protege contra infecção letal pelo vírus Nipah". O estudo usou o domínio da cabeça da proteína G do nipavírus como alvo de antígeno para desenvolver com sucesso uma nova vacina de nanopartículas de proteína auto-montada segura e eficaz que pode induzir anticorpos neutros de amplo espectro que inibem várias infecções por henipa e protegem hamsters infectados pelo nipavírus.

Zhou, D. et al.

Vacinas npj 9, 158 (2024).

https://doi.org/10.1038/s41541-024-00954-5

A estabilidade térmica da proteína refere-se à capacidade de deformação da cadeia de polipéptidos da proteína sob o efeito da temperatura, principalmente refletida nas mudanças nas propriedades químicas da cadeia de polipéptidos e na configuração espacial quando a temperatura muda, quanto menor a mudança, maior a estabilidade térmica. A estabilidade térmica das proteínas é afetada por diferentes temperaturas, pH, intensidade iónica e outros fatores externos, que são importantes em áreas como biotecnologia, desenvolvimento de medicamentos e indústria alimentar.

Temperatura de degeneração da proteína é um conceito importante para os biólogos estudar a estabilidade térmica da proteína, refere-se ao ponto de temperatura em que a proteína é submetida ao efeito térmico em condições de temperatura específicas, sua estrutura muda, quando a temperatura é geralmente mais alta, a proteína muda de uma estrutura tridimensional estável para uma estrutura desordenada solta. A estabilidade térmica das proteínas é geralmente expressa pela temperatura do ponto médio de degeneração térmica (Tm), ou seja, a temperatura em que a proteína é dobrada em 50%.

01 Preface

O Nipa Virus (NiV) é um vírus de RNA de cadeia única negativa que foi originalmente isolado e identificado durante surtos na Malásia e Cingapura entre 1998 e 1999. A infecção pelo NiV pode causar encefalite grave e doenças respiratórias, com taxas de mortalidade de até 75%. Também foram observadas relapses de doenças neurológicas de longo prazo e infecção pelo NiV nos sobreviventes. Ainda não há vacinas ou tratamentos aprovados para uso humano. O NiV codifica uma proteína da membrana viral: a glicoproteína (G), a proteína G localizada na superfície do vírus, responsável pelo reconhecimento e ligação do receptor, que depois de se ligar ao receptor, passa por uma série de mudanças de configuração para completar a fusão da membrana com a célula-alvo, ajudando assim o vírus a entrar na célula-alvo e desencadear a infecção. Além disso, muitos anticorpos neutros e protetores visam principalmente a proteína G, sugerindo que a proteína G do vírus é um antígeno-chave para o desenvolvimento de vacinas. Várias plataformas de vacinas contra a infecção pelo NiV foram desenvolvidas recentemente, incluindo subvacinas, mRNAs、 As partículas semelhantes a vírus (VLP), as vacinas portadoras de vírus e as vacinas de DNA ainda não foram avaliadas para a infecção por NiV em plataformas de nanopartículas auto-montadas.

02 Resumo

Os autores projetaram uma nanopartícula auto-montada baseada em ferroína que mostra o domínio da cabeça NiV G (NiV G-ferroína, NiV G-ferritin）， A resposta imunológica desencadeada pelo domínio da cabeça G solúvel do NiV (NiV sG) ou pela ferroína G do NiV foi avaliada e uma série de dados de estudo sugeriu que a ferroína G do NiV é uma vacina candidata segura e eficaz para a infecção por Nipa.

03 resultados

Os autores usaram o analisador de estabilidade da proteína PSA-16 independentemente desenvolvido pela Beijing Buster Technology Co., Ltd., através do princípio da fluorometria de varredura diferencial (DSF) para a análise de estabilidade térmica da NiV G-ferritina e NiV sG, os resultados mostraram que a NiV G-ferritina e NiV sG mostraram estabilidade térmica semelhante, Tm de ~ 65 ° C, indicando que a fusão de NiV G e ferritina não teve um efeito significativo sobre sua estabilidade estrutural.

04 Metodologia

O analisador de estabilidade da proteína PSA-16 (Beijing Buster Technology Co., Ltd.) determina a estabilidade térmica da proteína alvo por fluorometria de varredura diferencial (DSF). Diluir a amostra a 0,5 mg / mL e carregar a amostra diluída de 20 μL em um tubo de vidro de quartzo.

Medir dinamicamente em tempo real a intensidade de fluorescência (F) de 330nm e 350nm da proteína alvo sob excitação UV de 280nm usando varredura de temperatura linear de 23 a 97 ° C a velocidades de aquecimento de 1 ° C / min.

Calcule o ponto médio de transição térmica (Tm) com base na inclinação da curva F350nm/F330nm. Cada amostra foi medida em paralelo quatro vezes.

Parte 01 - Passos experimentais

1) Ao realizar um experimento de estabilidade térmica, primeiro defina a temperatura inicial. A temperatura inicial do ZUI é baixa em 15 ° C e pode ser ajustada através do botão "+" "-".

2) Após a definição da temperatura inicial, a temperatura final pode ser definida. A temperatura final é de 110 ° C e pode ser ajustada através do botão "+" "-".

3) Após definir a temperatura inicial e final, defina a taxa de aquecimento. A taxa de aquecimento pode ser ajustada na faixa de 0,1-15 ℃ / min.

4) A sensibilidade de detecção pode ser selecionada de acordo com a concentração da amostra. A alta sensibilidade de detecção é adequada para amostras de 0,05-1 mg / ml, a sensibilidade de detecção média é adequada para amostras de 1-10 mg / ml e a baixa sensibilidade de detecção é adequada para amostras acima de 10 mg / ml.

5) Após definir os parâmetros acima, você pode clicar para selecionar a amostra que precisa ser testada e digitar o nome da amostra. As amostras selecionadas são indicadas por uma caixa azul.

6) Após a definição dos parâmetros, clique no botão "pré-digitalização". O instrumento varredura a amostra para verificar se os valores de fluorescência estão em conformidade com os requisitos experimentais.

7) Após a pré-digitalização, clique no botão "Iniciar Experimento" para realizar o teste de estabilidade térmica.

Parte 02 - Resultados da Experiência

8) Após a conclusão do teste, o software analisa os dados automaticamente e entra na interface de visualização dos resultados.

9) Na interface de visualização de resultados, a curva de deformação de cada amostra, a derivada de primeira ordem da curva de deformação, o valor Tm da temperatura de deformação e o valor Ton da temperatura inicial de deformação são exibidos.

10) Se o software não reconhecer automaticamente o pico da derivada de primeira ordem, você também pode adicionar instruções manualmente através do botão "Adicionar Marcador".

11) Para exportar dados brutos ou imagens, você pode fazer isso através dos botões "Exportar dados" e "Exportar imagens".

Os autores também agradeceram à Beijing Buster Technology Co., Ltd., por fornecer o analisador de estabilidade de proteína PSA-16 independentemente desenvolvido para obter dados de análise de estabilidade térmica de amostras de proteínas.

05 Fluorescença de varredura diferencial de origem endônica (inDSF)

Fluorescença de varredura diferencial endógena inDSF, com base nas propriedades fluorescentes de aminoácidos específicos em proteínas. A intensidade de fluorescência destes aminoácidos está estreitamente relacionada ao microambiente em que se encontram e, portanto, o sinal de fluorescência destes aminoácidos também muda quando a estrutura da proteína muda. Não é necessário adicionar corantes fluorescentes adicionais ao sistema de detecção, aproveitando o princípio de iluminação espontânea dos aminoácidos aromáticos internos da proteína. Não é necessária nenhuma marca adicional ou passos fixos para evitar a introdução de incertezas nos resultados.

Os estudos descobriram que os aminoácidos aromáticos em moléculas de proteínas se deslocam no espectro de emissão máximo da fluorescência endogênica estimulada quando estão em microambientes de diferentes polaridades (por exemplo, em ambientes hidrofóbicos ou hidrofílicos). A fluorescência endógena nas proteínas vem principalmente de aminoácidos anílicos aromáticos, como a triana (Trp), a fenilalanina (Phe) e a tirosina (Tyr), onde a fluorescência endógena da triana ZUI é forte. Quando está dentro da proteína, a luz emitida é principalmente na banda de 330, e uma vez que a proteína é dobrada e exposta ao solvente, a luz emitida se desloca do comprimento de onda vermelho de 330 para 350. Assim, através da estimulação 280, a alteração da relação 330/350 é detectada para medir o Tm da proteína.

Por exemplo, no microambiente nucleoso de hidrofobia proteica, o comprimento de onda de emissão máximo de fluorescência endogênica é de cerca de 330 nm, enquanto que no microambiente polar hidrofílico, o comprimento de onda de emissão máximo de fluorescência endogênica da tritina é de cerca de 350 nm. A degeneração térmica ou química das proteínas geralmente provoca uma mudança de polaridade no microambiente ao redor dos resíduos de trânea, o que faz com que a trânea normalmente enterrada no núcleo proteófobo seja gradualmente exposta a um ambiente hidrofílico, o que resulta em um deslocamento em vermelho do comprimento de onda máximo de emissão de fluorescência endógena, ou seja, para uma área de comprimento de onda maior.

Características: DSF de fluorescência de varredura diferencial endogênica não requer processamento de amostras ou etapas de marcação complexas, o experimento é relativamente fácil. Mas nem todas as proteínas contêm grupos fluorescentes suficientes e podem ser afetados por outros grupos.

06 Analisador de estabilidade da proteína PSA-16

Em 2023, a Beijing Buster Technology Co., Ltd. lançou o primeiro analisador de estabilidade de proteínas doméstico independentemente desenvolvido, o PSA-16.

O desempenho e os parâmetros do PSA-16 atingem o nível dos equipamentos importados, mas o preço é muito inferior ao dos produtos importados, o que compensa a lacuna atual dos equipamentos autónomos domésticos no campo da análise da estabilidade das proteínas.

Parâmetros principais ★ Parâmetros de medição: Tm, Cm, ΔG, etc.;

Fluxo de amostra: 16;

Volume da amostra: ≤20 uL;

Gama de concentração: 0,01-200 mg / ml;

Gama de controle de temperatura: 15-110 graus;

Velocidade de mudança de temperatura: 0,1-15 graus / minuto;

Repetibilidade Tm: CV inferior a 1%;

★ Parâmetros de consumo: Único, sem necessidade de limpeza;

★ design de oito linhas, adaptado a pipetas multicanal;

Analisador multifuncional de estabilidade da proteína PSA-16A tecnologia de fluorescência de varredura diferencial endossocial (ifDSF) é amplamente usada em pesquisas de estabilidade de proteínas, engenharia de otimização de medicamentos macromoleculares de proteínas (anticorpos), triagem de pequenas moléculas de medicamentos para alvos de doenças de proteínas e medição de força de ligação, com muitas vantagens como velocidade, precisão e alto fluxo. As propriedades fluorescentes da trônica/tirosina em proteínas estão intimamente relacionadas ao ambiente em que se encontram e, portanto, a estabilidade química e térmica das proteínas pode ser determinada detectando mudanças de fluorescência na trônica/tirosina interna durante o aquecimento ou a adição de agentes de alteração.

O PSA-16 usa a tecnologia de detecção de comprimento de onda duplo ultravioleta para determinar com precisão as mudanças na fluorescência de trônica e tirosina durante o processo de desdobramento da proteína e obter dados como o valor Tm e o valor Cm da proteína; A medição não requer a adição de corantes adicionais, não é limitada pelas condições de tampão e a ampla gama de concentrações de amostras de proteínas testadas (10 µg/ml - 250 mg/ml) é amplamente utilizada para estudos de estabilidade de proteínas de membrana e anticorpos de alta concentração em ambientes de descalcificantes. Além disso, o PSA-16 possui velocidades de captura de dados muito altas, permitindo a obtenção de dados de resolução ultra-alta. Simultaneamente, o PSA-16 pode medir até 16 amostras simultaneamente, com alto fluxo; Apenas 15 uL por amostra são necessários e a quantidade de amostra é baixa, o que torna-o ideal para triagem de alto fluxo. O PSA-16 é simples de operar, sem necessidade de limpeza após o uso e quase sem custos de manutenção.

As aplicações do analisador de estabilidade de proteína multifuncional PSA-16 abrangem áreas multidisciplinares como plantas, biologia, ciências animais, veterinária, microbiologia, fermentação industrial, ciências ambientais, fundamentos agrícolas e engenharia de proteínas. As proteínas são as moléculas biológicas que, em última análise, determinam a função, envolvendo-se e influenciando todo o processo de atividade da vida. Muitas direções da biologia molecular moderna, ciências ambientais, animação zoológica, fundamentos agrícolas e outras várias disciplinas de estudo envolvem a pesquisa da função das proteínas, bem como a análise de vários métodos biofísicos e bioquímicos a jusante, fornecendo amostras de proteínas estáveis ​​é um pré-requisito para todos os estudos de proteínas. Portanto, os sistemas multifuncionais de análise de estabilidade de proteínas têm um significado fundamental em todas as disciplinas.

1. Triagem de alto fluxo de anticorpos ou preparados de vacinas, preparados enzimáticos

Estabilidade química de anticorpos ou vacinas, preparações enzimáticas, avaliação de estabilidade a longo prazo, estudos de estabilidade isotérmica, etc.

Avaliação Biosimilar (Biosimilar Evaluation)

Estudo de Medicamentos Anticorpos Acoplados (ADC)

5. Estudo de propriedades de desdobramento de domínio multi-estrutural

6. Estudo de degradação forçada em condições físicas e químicas

Estudo da variabilidade das proteínas (capacidade de replicação, dinâmica de replicação, etc.)

Triagem de descalcificante de proteínas de membrana, triagem de ligantes de ligação de proteínas de membrana (ensaio de mudança térmica)

Triagem de drogas de pequenas moléculas de alto fluxo baseada em alvos (Thermal Shift Assay)

10. Otimização rápida das condições de purificação de proteínas, etc.