Colcultura de órgãos intestinal-hepático em série para estudar a absorção de medicamentos e processos toxicos

Para compensar as limitações dos modelos animais, novos modelos de avaliação de segurança de medicamentos foram propostos para * e reduzir os modelos existentes. Para simular a absorção e o metabolismo de medicamentos no sistema microfisiológico intestinal-hepático (MPS) in vitro e prever os efeitos farmacocinéticos e toxicos, cientistas do Instituto de Avaliação de Segurança do Instituto de Pesquisa de Alimentos e Medicamentos da China (Centro Nacional de Monitoramento da Avaliação de Segurança de Medicamentos), da Academia de Ciências Médicas da China e da Escola de Medicina Concorde de Pequim, da TissUse GmbH, na Alemanha, colaboraram para criar um chip de cultura em série intestinal-hepática para detectar o processo de dano hepático agudo após overdose de APAP (paracetaminofenol),O estudo foi publicado em setembro de 2024 na revista Food and Chemical Toxicology.

Os órgãos intestinais foram construídos usando as linhagens celulares Caco-2 e HT29-MTX-E12, enquanto os orgânicos hepáticos foram construídos usando HepG2, HUVEC-T1 e THP-1 induzido por PMA, bem como células estelares do fígado humano. Determine as concentrações de APAP com cromatografia líquida de alta eficiência e ajuste os parâmetros farmacocinéticos por meio de análises não-câmaras com o software Phoenix. Alterações nos biomarcadores de dano hepático aspartic transaminase e alanina transaminase, bem como marcadores de função hepática proteína, sugerem que a cultura de curto prazo em ambos os modelos de chip de órgão foi estável durante 4 dias. Após a administração de paracetaminofenol (APAP), o sinal de oxigênio ativo foi aumentado, enquanto o potencial da membrana mitocondrial foi reduzido, a caspase-3 (cisteína aspartina protease-3) foi ativada e o sinal p53 foi aumentado, indicando que a overdose de APAP desencadeou uma resposta tóxica. No modelo de sistema multiorgánico do fígado intestinal, ajustamos os parâmetros de toxicocinética e simulamos o processo de toxicidade hepática após overdose APAP, o que ajudará na aplicação de chips de órgãos na detecção de toxicidade de drogas.

1. Introdução

A lesão hepática farmacológica (DILI) é o principal obstáculo ao desenvolvimento de medicamentos e pode levar à retirada do mercado (2021; 2016). As diferenças entre o modelo animal e o corpo humano e os requisitos éticos cada vez mais rigorosos tornaram necessário a adoção de novos modelos de avaliação da segurança dos medicamentos (2014). Este sistema de microfisiologia (MPS), também conhecido como “órgão no chip”, é um dispositivo construído combinando microfluidismo, microfabricação e cultura celular tridimensional (3D). É capaz de reproduzir funções orgânicas fisiologicamente relacionadas para modelos animais. A plataforma MPS é um ambiente fisiológico in vitro miniaturizado (Shinohara et al., 2021).

Isso permite simular e controlar com precisão os gradientes químicos e as forças biomecânicas para simular o ambiente in vivo e responder. Os canais de microfluidos pré-definidos atuam como vasos sanguíneos engenhados, reproduzindo a função fisiológica dos tecidos no corpo (Low et al., 2020) e permitindo a união com outros sistemas de múltiplos órgãos (Kulthong et al., 2020). Além disso, os sistemas de múltiplos órgãos permitem o monitoramento da função do tecido em tempo real (Milani et al., 2022).

O modelo de chip multi-órgão serializado por microcanal é capaz de simular ainda mais a resposta dinâmica humana e as interações internas dos órgãos (Arakawa et al., 2020) e fornecer evidências complementares da relação entre a exposição à droga e o efeito / toxicidade da droga. O intestino e o fígado são os principais órgãos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) e, portanto, são importantes nos estudos farmacocinéticos (PK) (Vernetti et al., 2017).

A droga oral é absorvida diretamente no sangue através do trato digestivo e intestinal, afetando a biodisponibilidade da droga e a dose corporal. O modelo do chip intestinal pode simular a absorção de medicamentos e descrever a ADME e as concentrações de medicamentos no sangue (Milani et al., 2022). Lee et al. (2017) construíram um chip de fígado intestinal tridimensional para retratar um modelo farmacocinético do paracetaminofenol (APAP), enquanto Arakawa et al. (2020) construíram um modelo intestinal-fígado para cálculos quantitativos in vitro do metabolismo contínuo de SANzolam. Milani et al. (2022) avaliaram a quantidade de precursores farmacêuticos produzidos devido ao metabolismo dos macofenoles no intestino e no fígado. Portanto, métodos semelhantes podem ser aplicados a outros MPS multi-órgãos para estudar os processos farmacoeficológicos no corpo humano.

Apenas alguns exemplos foram relatados de sistemas de chips multi-órgãos que realizam simultaneamente testes de toxicidade e identificação de amostras. Liu et al. (2020) estudaram a absorção, o metabolismo e a toxicidade do complexo K de saponina de ginseng com base em um sistema de chips de múltiplos órgãos baseado em chips de intestino, vasos sanguíneos, fígado e rins. Jeon et al. (2021) relataram um chip de fígado intestinal que reproduz a absorção de ácidos graxos e subsequente acumulação de lípidos no fígado.

Para explorar o sistema microfisiológico intestino-fígado in vitro, aqui, desenvolvemos um chip de órgão duplo intestino-fígado reprodutível ligando culturas intestinais a esferas fígadas 3D construídas usando quatro linhagens celulares em um chip de órgão duplo (2OC). Analisamos a função do chip detectando os níveis de biomarcadores funcionais e proteínas e, em seguida, testamos a toxicidade hepática no chip adicionando o composto tóxico para o fígado para acetaminofenol (APAP) à câmara intestinal para simular a toxicidade hepática após a absorção do medicamento. Após 48 horas de incubação, a distribuição de medicamentos e sinais de toxicidade hepática foram detectados em ambas as câmaras.

2. Materiais e métodos

2.1. Células e culturas Recursos celulares e métodos de cultura para informações adicionais.

2.2. Cultura intestinal

Para construir um modelo intestinal em uma placa de cultura Transwell, as células Caco-2 foram inoculadas em uma placa de cultura Transwell (Merck, PIHP01250) com uma densidade de 1 x 10-6 células/buraco. Misture as células Caco-2 e HT29-MTX-E12 em uma proporção de 9: 1 e vacine em cada placa na mesma concentração. Do dia 0 ao dia 7, substitua o meio a cada dois dias e uma vez por dia após o dia 7.

2.3. Cultura 3D (fígado)

Com base em nosso estudo anterior (Sun et al., 2024), as células THP-1 foram diluídas a 5 x 10-5 células/ml em meio RPMI 1640 e tratadas com 25 nmol de ácido fosforil acético (PMA, MedChemExpress) por 48 horas em placas de 6 buracos. Em seguida, cultivo no meio durante 24 horas e triagem com TryplE (Gibco), as células THP-1 induzidas pelo PMA foram coletadas. 2 HepG2、 As células endoteliais T1, THP-1 e células estelares do fígado humano (HHSC) foram coletadas após a digestão e a suspensão celular foi misturada em uma proporção de 60:19:15:6. Para formar uma quantidade equivalente de células, 100 células por orificio são vacinadas após diluição em uma placa de 96 orificios de parede baixa tipo U de fundo redondo (Shenzhen Liver Biotechnology Co., Ltd., LV-ULA002-96UW). Substituir metade do meio a cada dois dias. A morfologia esférica foi observada e medida usando um analisador de imagem celular de alta connotação (Perkin Elmer Inc., série Opretta).

2.4. Co-cultura intestinal-fígado baseada em chips

A placa HUMIMIC Chip2 de 24 furos (TissUse GmbH, Alemanha) foi fabricada de acordo com o esquema recomendado (Wagner et al., 2013). No 14º dia após a construção do modelo intestinal, a quimera de células Transwell foi adicionada à câmara de cultivo de 24 poços e 50 esferas foram adicionadas à câmara de cultivo de 96 poços para formar um modelo de chip intestino-fígado.

De acordo com métodos anteriores (Lin et al, 2020), em um ciclo de microcanal 2OC, a co-cultura foi realizada usando 600 ul de meio circular e 400 ul de meio localizado no topo da barreira.

O meio na câmara do fígado é substituído uma vez por dia e coleta e substitui metade do líquido líquido circulante. No final da cultura total de 7 dias, os marcadores da função específica do órgão do fígado foram analisados usando imunofluorescência. Configure a bomba de microfluxo na placa para a frequência de 0,8 Hz.

2.5. Integridade dos órgãos intestinais

A resistência trans-endotelial (TEER) e o coeficiente de epipermeabilidade intestinal (Papp) de fluorescente sódio e fluorescente isocianato de fluorescente 40 kDa-glucose foram medidos em diferentes pontos de tempo para avaliar a integridade dos órgãos intestinais. Ver métodos para informações adicionais.

2.6. Avaliação do desempenho dos órgãos hepáticos

No modelo de fígado, uma viabilidade celular bicolor fluorescente sensível foi escolhida para distinguir entre células vivas e células mortas. Usar a fluorescentina AM de cálcio amarelo-verde (um corante penetrante celular) como indicador de células vivas e iodado BOBO-3 (Invitrogen Inc.) como indicador de células mortas. Os componentes de células vivas produzem fluorescência verde intensa e uniforme (excitação / emissão 488 nm / 515 nm) em células vivas, enquanto os componentes de células mortas produzem principalmente fluorescência vermelha do núcleo celular (excitação / emissão 570 nm / 602 nm). Vários biomarcadores foram medidos no serum superior obtido usando um modelo de chip de órgão hepático estabelecido. Avaliamos os níveis de albina (ALB), úrea (UREA), aspartina transaminase (AST) e alanina transaminase (ALT), indicadores do metabolismo e danos hepáticos. De acordo com as instruções do fabricante, o teor de adenosina trifosfato (ATP) foi medido com o Cell Titor Glo 3D (Promega). A bilixil-lisina-fluorescina (CLF) é um ácido biliar marcado por fluorescina que tem um comportamento biológico muito semelhante à bilixilglicina natural. Para visualizar os vasos biliares em um modelo de fígado 3D, preparamos 20 micromoles de líquido de reserva de CLF e incubamos o modelo a 37 ° C por 2 horas. Tinha com Hoechst 33342 e incube durante 10 minutos. As células são lavadas três vezes com um meio vermelho sem fenol e o sinal fluorescente é detectado a um comprimento de onda de excitação / emissão de 498/517 nm.

2.7. Morfologia e imunocoração

Como mencionado anteriormente (Sun et al, 2024), partes equivalentes do intestino e do fígado são fixadas com poliformaldeído e desidratadas com solução de sacarose. As fatias congeladas são cortadas antes de serem tingidas com sumicina-erythritol (HE), alto iodo-Shif (PAS) ou imunocornição. Para imunocoração, as fatias são lavadas três vezes com PBS com PBS contendo 0,5% de Triton X-100 (Solbo), o tempo de tratamento e o tratamento de perfuração são 10 minutos, fechado com soro de cabra (Beyotime Biotechnology) durante 30 minutos e realizado a temperatura ambiente. Siga as instruções para adicionar um antígeno a cada buraco com uma certa diluição e incubar durante a noite a 4 ° C. Usar um dos seguintes antígenos: anti-Occludin (91131S, CST, diluição 1:400), anti-ZO-1 (ab221547, Abcam, diluição 1:100), anti-MRP2 (ab172630, Abcam, diluição 1:500) e anti-PGP (código 25081-2-AP, ProteinTech, diluição 1:500). Limpar as células, tratar com o antígeno duplo fluorescente correspondente e co-localizar com DAPI (Beyotime Biotechnology). Observar a morfologia de campo de visão aberto e cortes com um analisador de imagem celular de alta connotação ou um microscópio (Olympus IX71). Para a coloração imunofluorescente in situ, a membrana intestinal e o modelo de fígado 3D são lavados três vezes com PBS e fixados com 4% de poliformaldeído por 30 minutos. Em seguida, a amostra foi perfurada durante 10 minutos em PBS contendo 0,5% Triton X-100 (Solbo) e fechada durante 30 minutos a temperatura ambiente com soro de cabra (Beyotime Biotechnology). De acordo com as instruções, os anticorpos in situ diluídos são adicionados a cada buraco com uma certa diluição e incubados durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos in situ utilizados incluem: anti-Occludin (91131S, CST, diluição 1:400), anti-ZO-1 (sc-33725, Santa Cruz Biotechnology, diluição 1:500), anti-MRP2 (ab172630, Abcam, diluição 1:500), anti-ABCB11/BSEP (ab255605, Abcam, diluição 1:100), anti-PGP (Cat No. 25081-2-AP, ProteinTech, diluição 1:500), anti-CYP3A4 (MA5-17064, ThermoFisher, diluição 1:1000), anti-Ki67 (9449S, CST, diluição 1:10.000), anti-CD31 (3528S, CST, diluição 1:100), anti-CD68 (ab213363, Abcam, diluição 1:100), anti-SMA (14395-1-AP, ProteinTech, diluição 1:100), anti-caspase-3 anti-fissurante (9664S, CST, diluição 1:400) e anti-p53 (2524S, CST, diluição 1:2000). As células são lavadas, incubadas com anticorpos secundários ligados à fluorescência e co-localizadas com DAPI (Beyotime Biotechnology). Os anticorpos secundários utilizados incluem: cabra anti-coelho IgG H & L (Alexa Fluor) ® 488) (ab150077, Abcam, diluído 1:1.000), IgG anti-rato de cabra (H + L) (Alexa Fluor) ® 555 Conjugado) (4417, CST, diluição 1:1000) e cabra anti-IgG H&L (Alexa Fluor) ® 488) (ab150113, Abcam, diluído em 1:1.000). Os resultados foram avaliados por meio de análise de alto teor e microscópio fluorescente.

2.8. Determinação de toxicidade farmacológica e vitalidade celular

Como mencionado anteriormente (Sun et al., 2024), o Cell Titor Glo foi usado para detectar a vitalidade celular e medir a taxa de sobrevivência celular e a taxa de sobrevivência celular (%). Em uma placa de 96 buracos, as células são inoculadas em uma placa de 96 buracos com uma densidade de 1 x 10-4 células / buraco; No dia seguinte, descarte o soro e cultive com paracetaminofenol (4 mmol). Use o mesmo método para medir a taxa de sobrevivência da esfera. O teste é realizado usando um fotométrico.

2.9. Simulação do processo oral de aspirina em chips de co-cultura

Sete modelos de 2OC foram carregados, quatro dos quais foram administrados por microcanal para acetaminofenol (APAP), e o resto do circuito não foi administrado. Para simular o processo oral e as consequências da toxicidade hepática induzida pelo APAP, no dia seguinte ao carregamento do circuito 2OC, acrescente 400 microlitros de 10 mmol de APAP ao topo do inserto. Recolha 10 microlitros de soro em 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 32 e 48 horas, respectivamente, para análise quantitativa por cromatografia líquida. 48 horas após a administração, o soro é coletado para medição de vários biomarcadores para avaliar a resistência transcutânea (TEER). As esferas hepáticas também são coletadas para avaliação de toxicidade hepática. Nós também coletamos pelo menos 3-5 para medição da vitalidade celular, e o resto foi transferido para uma placa de 96 orifícios para conservação para coloração fluorescente.

2.10. Avaliação de toxicidade hepática em chips de co-cultura

Medir a vitalidade celular e os níveis de albina (ALB), aspartina aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) de acordo com o esquema de kit recomendado para avaliar a lesão hepática 48 horas após a administração do medicamento. Determine o potencial da membrana mitocondrial usando o kit de teste de potencial da membrana mitocondrial (Beyotime Biotechnology, C2001S). Transfira o modelo 3D do fígado do chip 2OC para uma placa de 96 buracos. Detectar sinais fluorescentes de tetrametil-rodaminacetil (TMRE) e Hoechst 33342 em Ex/Em = 550/575 e 350/461 nm, respectivamente. Determine o estresse oxidativo com o reagente de estresse oxidativo CellROX (Symerfisch Technology, C10444). Transfira o modelo de fígado 3D incorporado do chip 2OC para uma placa de 96 buracos. Os sinais fluorescentes de CellROX e Hoechst 33342 foram detectados a 485/520 nm e 350/461 nm, respectivamente. Detecção in situ de sinais de Ki-67, caspase-3 e p53 fissados com cromatografia imunofluorescente para avaliar a capacidade de proliferação celular e apoptose.

2.11. Quantificação da amostra

Com base em métodos anteriores (Marin et al., 2019), as concentrações de acetaminofenol (APAP) foram medidas usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Shimazu, LC-2040C 3D). A câmara lateral da base (câmara do fígado) é preenchida com meio fresco, enquanto a câmara lateral superior é exposta ao meio de paracetaminofenol. Em cada ponto do tempo, como descrito na secção 2.9, pegue 10 microlitros de amostras de ambos os lados. Escolha o metanol como precipitante de proteína e, após a adição de 30 microlitros de metanol para precipitar a proteína, remova o precipitado por meio de uma centrífuga (13.000 rotações/min, 4 ° C, 15 minutos). Utilizando colunas cromatográficas inertes e sustentáveis C18 (comprimento de 150 mm, diâmetro interno de 4,6 mm, tamanho de partícula de 5 microns, Shimazu). Use duas fases de fluxo: o solvente A (metanol) e o solvente B (água destilada) com uma velocidade de fluxo de 0,8 ml/min. A composição do solvente é de 5% A durante 0 a 4 minutos, de 5 a 100% A durante 4,01 a 10 minutos e de 5% A durante 10,01 a 15 minutos. O volume de amostragem é de 10 microlitros e é detectado usando um detector de matriz de diodos fotoeletrônicos (PDA) (comprimento de onda 280 nm). Determine a concentração de acetaminofenol usando curvas padrão. Os parâmetros farmacocinéticos foram ajustados em Phoenix WinNonlin (Certara, EUA) usando um modelo de câmara não-câmara (NCA). Usando a interpolação linear trapezoidal linear como método de cálculo, o tipo de modelo é definido como plasma e a opção de dosagem é definida como extravascular. Os dados de concentração e tempo de paracetaminofenol (APAP) em compartimentos hepáticos medidos por cromatografia líquida de alta eficiência são ajustados para determinar a área sub-curva (AUC) entre 0 e 48 horas. As concentrações de pico (Cmax) e o tempo de chegada ao pico (Tmax) foram lidos diretamente a partir das curvas de concentração e tempo individuais (HQ, 2022; Wang et al., 2022). Detecção de sinais de NAPQI com cromatografia líquida de alta eficiência - espectrometria de massa em série (UPLC-MS) (Zhang et al., 2018). Prepare uma solução de reserva de 1 mg/ml dissolvendo a N-acetil-parafenolamina (NAPQI) (MCE, HY-66005) em metanol e dilua ainda mais com metanol para uma solução de trabalho de 1 μg/ml. A formação do NAPQI foi analisada. 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 32 e 48 horas após a administração do paracetaminofenol (APAP), o teste foi realizado por cromatografia líquida de alta eficiência - espectrometria de massa (UPLC-MS) com sistema AB SCIEX LC AC, detector PDA e triplo quadrupolo 6600+. A separação cromatográfica foi realizada usando a coluna cromatográfica Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 mm x 50 mm). 1,7 milímetros). A lavagem utilizada é uma solução de água de ácido fórico a (A) 0,1% (proporção volumétrica) e (B) metanol, separados usando um procedimento de lavagem em gradiente, como mostrado na Tabela S1. A velocidade de fluxo da cromatografia líquida ultra-eficiente é de 0,3 mL/min e a análise de cromatografia líquida ultra-eficiente - espectroscopia de massa utiliza amostras de 10 microlitros. Os pares de íons correspondentes ao potencial de despolimerização, energia de colisão, distribuição de energia de colisão e temperatura são caracterizados em m/z 149,98-108,04 (30, 30, 15 e 350), correspondendo ao NAPQI.

2.12. Análise estatística

A variável contínua é expressa como desvio médio ± (desvio padrão). O teste t de estudante de cauda dupla é usado para estudar as diferenças entre duas amostras independentes. A análise de dados foi realizada usando a versão 25 do IBM SPSS Statistics (IBM Corporation). O modelo de regressão linear foi realizado usando o SPSS e o GraphPad Prism 7.00 (software GraphPad). O significado estatístico foi definido como P≤0,05.

3. Resultados

3.1. Cultura de órganos

Vacina a mistura celular com densidades de 1 x 10-6, 5 x 10-5 e 2,5 x 10-5 células / buracos em placas de cultura Transwell para obter um modelo intestinal in vitro. A resistência transepitelial (TEER) em todos os grupos atingiu 300 Ω cm2 em 21 dias, com o grupo de co-cultura de alta densidade atingindo 300 Ω cm2 em 12 dias (Figura 1A). No dia 14, o sódio fluorescente e o poliglicose fluorescente no modelo de grupo de co-cultura de alta densidade cumpriram os requisitos do teste de permeabilidade (Figura 1B). Quando a resistência transepitelial atinge 200-1000 Ω cm2, a camada única de Caco-2 pode ser considerada completa (Iftikhar et al., 2020). Em experimentos de seguimento, grupos de cocultura de alta densidade foram selecionados para formar a barreira intestinal. O ligador de estreita Occludin e ZO-1 foram tingidos para mostrar sua integridade em condições de cultura de equivalentes intestinais. Nos dias 7 e 21, observamos a estrutura de rede contínua de Occludin (Figura 1C), enquanto que nas secções dos dias 14 e 21, Occludin e ZO-1 apresentaram estrutura de rede (Figura 1D, Figura S1A), indicando que a barreira intestinal foi considerada intacta no dia 14. Nos dias 14 e 21, a proteína transportadora MRP2 e PGP foram distribuídos em um lado do corte intestinal (Figura 1E, Figura S1B), indicando a polaridade do modelo intestinal. No geral, os resultados indicaram que os equivalentes intestinais obtidos no dia 14 tinham conexões estreitas e polaridade; Assim, no dia 14, a barreira intestinal é considerada madura e utilizada para mais experimentos. Na Figura 2A, o diâmetro do modelo aumenta rapidamente em 10 dias e se estabiliza em cerca de 400 micrômetros. A coloração HE mostrou nenhum núcleo necrotico evidente no dia 7 (Figura 2B), mas no dia 10 (Figura 2B) houve um núcleo necrotico leve ou várias apoptoses celulares, e no dia 14 (Figura S1I) houve uma área de necrosis centrais graves. Consistente com a distribuição de células mortas mostrada pela coloração de células vivas / mortas (Figura 2C), mais células mortas foram detectadas no dia 10. A quantidade total de ATP no modelo aumentou continuamente (Figura S1C), enquanto a secreção de lactato deshidrogenase (LDH) não aumentou significativamente (Figura S1D). O modelo cresceu de forma estável e, com o prolongamento do tempo de cultura, o número de células necroticas aumentou e as células necroticas internas não foram detectadas através da detecção dos níveis de LDH no serum superior. Para evitar a formação de núcleos necroticos, estes resultados indicam que o tempo de cultivo é limitado a 7 dias. No dia 7 (Figura 2D) e no dia 10, os sinais fluorescentes das células endoteliais umbilicais humanas T1 (HUVEC-T1), dos macrófagos vesiculares humanos THP-1 e das células estelares hepáticas humanas HHSC foram rastreados por cromoscopia imunofluorescente através de sinais CD31, CD68 e α-SMA, respectivamente.

Figura S1G mostra que os três tipos de células acima ainda estão presentes na esfera no dia 10.As proteínas transportadoras MRP2, PGP e BSEP foram detectadas no dia 7 (Figura 2E) e a função de extração de ácido biliar foi rastreada através da sonda fluorescente CLF (Figura S1H). A CLF é um substrato para MRP2 e BSEP (Boaglio et al, 2010), e o sinalizador da CLF também indica a função dessas transportadoras nos organoides. Finalmente, a coloração PAS mostrou deposição de glicogênio (Figura 2B), e a tendência aumentada de ALB e UREA sugeriu que a função anabólica total do fígado não foi interrompida, mesmo em emergências de morte celular (Figura S1E-F). Estes resultados sugerem que os efeitos dos organoides sobre a função hepática foram relativamente estáveis ao longo de 14 dias.

3.2. Visão geral da construção e função do chip intestinal-fígado

No décimo quarto dia da construção do modelo intestinal, o intestino e 50 órganos hepáticos foram carregados em compartimentos separados para formar um modelo intestino-fígado-chip. Os compartimentos conectados permitem que o líquido circule por canais e câmaras, facilitando a co-cultura de dois tipos de órgãos. O sistema 2OC durou sete dias. A Figura 3 resume a vitalidade celular in vitro e a função intestinal e hepática após a construção do modelo 2OC. Monitoramos os níveis de TEER (Figura 3A) para avaliar a manutenção da barreira intestinal e, apesar das flutuações, o TEER permaneceu acima de 300, indicando que a integridade da barreira intestinal foi mantida continuamente, mesmo quando co-cultivada com o equivalente do fígado. Durante a cultura, foram medidos os níveis dos indicadores de função hepática ALB (Figura 3B) e UREA (Figura 3C) na câmara hepática. Os níveis de ALB aumentaram nos primeiros 3 dias e depois diminuíram, enquanto os níveis de UREA não mudaram significativamente. Além disso, os níveis de LDH, AST e ALT também foram avaliados para determinar a vitalidade celular do intestino e / ou órganos hepáticos (Figuras 3E e F). Os níveis de lactato deshidrogenase (LDH) aumentaram ligeiramente em ambas as câmaras, enquanto os níveis de aspartina aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) aumentaram à medida que o tempo de cultura se prolongava. Estes resultados sugerem mudanças na função e na vitalidade celular dentro do sistema 2OC, sugerindo que, apesar da manutenção da integridade dos órgãos intestinais, a função geral dos órgãos hepáticos e a vitalidade celular diminuíram inesperadamente. Em seguida, a comparação de sinalização de imunocoração de órganos hepáticos obtidos a partir de chips 2OC e placas de 96 buracos na base U (Figura 3G). Primeiro, durante a cultura de placas de U, o sinal Ki67 foi principalmente observado ao longo da borda da esfera e distribuído uniformemente dentro da esfera, embora sua intensidade fosse mais fraca após um total de 7 dias de cultura de chips 2OC. Os sinais PGP, MRP2 e BSEP ao longo da borda da esfera do fígado são mais fortes quando cultivados em placas U e também podem ser detectados dentro da esfera. Após um total de 7 dias de cultura em chips 2OC, foi observado um sinal de transferência forte ao longo da borda, com a intensidade de sinalização de PGP e MRP2 ligeiramente mais forte do que o sinal cultivado na placa U. Finalmente, a partir de ambos os métodos de cultura, o sinal do citocromo P450 (CYP) 3A4 foi disperso na esfera e o sinal foi ligeiramente melhorado no modelo 2OC. Estes resultados descrevem a função básica dos organoides hepáticos e mostram que Ki67, PGP e MRP2 são expressos de forma diferente nas esferas hepáticas em chips 2OC do que na placa de fundo U.

3.3. Avaliação da toxicidade da overdose de acetaminofenol em um chip de órgão binário 2OC

Antes de testar o chip 2OC, as células HepG2 e Caco-2 foram expostas a diferentes concentrações de paraacetaminofenol (APAP) por 48 horas. Quando as concentrações foram superiores a 16 mmol, a taxa de sobrevivência das células Caco-2 foi observada drasticamente (Figura S2A), enquanto que quando as concentrações de APAP foram superiores a 2 mmol, a taxa de inibição das células HepG2 foi superior a 20% (Figura S2A). Estes resultados sugerem que a toxicidade hepática intensa pode ocorrer na faixa APAP de 2 a 16 mmol, mas nenhum efeito tóxico significativo foi detectado nas células Caco-2. Nos organoides hepáticos, a taxa de sobrevivência celular caiu para abaixo de 80% quando a concentração excedeu 2,5 mmol (Figura S2B), e a taxa de sobrevivência dos organoides hepáticos foi medida de 70,69 ± 26,97% após 48 horas de tratamento com APAP de 4 mmol, consistente com a tendência de toxicidade evidente observada nas células HepG2. Com base nestes resultados, a dose é selecionada para mais testes nos órgãos intestinais. Para alcançar a concentração final de 4 mM, APAP de 10 mM foi administrado do lado superior durante 48 horas e mediu a sobrevivência e TEER para avaliar a vitalidade das células intestinais e a função de barreira. A vitalidade celular não diminuiu significativamente após a administração do medicamento em comparação com o grupo controle (Figura S2C). Embora o TEER mostre uma tendência decrescente (Figura S2D), ele permanece acima de 300 Ω cm2, atendendo aos requisitos de integridade da barreira intestinal. Estes resultados sugerem que o APAP tem uma citotoxicidade significativa para as células hepáticas, mas não prejudica a função de barreira intestinal nas concentrações detectadas. No chip 2OC, a camara superior contendo os órgãos intestinais maduros foi adicionada em condições de aspirina (APAP) em concentração de 10 mmol. Após 48 horas, as câmaras laterais da base mostraram uma taxa de sobrevivência de 83,94% por esfera, ligeiramente superior à taxa de sobrevivência da placa de fundo U (70,69%). Embora não houvesse diferença significativa na resistência transepitelial (TEER) (Figura 4A). Entre os dois grupos, os níveis de AST (Figura 3B) (P < 0,05) e ALT (Figura 3C) tiveram uma tendência ascendente em comparação com o grupo controle, enquanto os níveis de ALB diminuíram 48 horas após o tratamento (Figura 3D). AST, ALT e ALB refletem danos hepáticos, enquanto os níveis de TEER não refletem danos graves à barreira intestinal.

Finalmente, detectamos mudanças no sinal fluorescente após o processamento APAP. O sinal Ki67 detectado reflete mudanças na capacidade de proliferação celular (Figura 4E). No grupo de controle, o sinal Ki67 foi concentrado principalmente no lado e o sinal foi observado espalhado dentro da esfera. O sinal Ki67 após o tratamento tornou-se menos significativo no lado em comparação com o grupo controle, com o sinal concentrado principalmente no interior, provavelmente devido à exposição das células mais externas ao paracetaminofenol (APAP) por mais tempo do que as células internas, aumentando a inibição da proliferação celular. Em seguida, os níveis de CellROX foram detectados e um sinal mais forte foi observado no grupo APAP (Figura 4F). A apoptose induzida pela APAP foi observada na esfera hepática e inicialmente a TMRE foi usada para avaliar o potencial da membrana mitocondrial (Figura 4G). No grupo APAP, a intensidade do sinal diminuiu nos lados, enquanto a distribuição do sinal foi mais uniforme no grupo de controle, indicando que o potencial da membrana mitocondrial para as células laterais dentro da esfera diminuiu após a administração do APAP. Após 48 horas de incubação em um chip 2OC, a expressão da cisteina-aspartina protease-3 (Figura 4H) e p53 (Figura 4I) apoptoticamente fissada no grupo de pancreatite aguda (APAP) mostrou sinalização mais forte da cisteina-aspartina protease-3 fissada e sinalização de p53 ligeiramente melhorada. Estes resultados sugerem que a inibição da proliferação esférica hepática induzida pela pancreatite aguda, o estresse oxidativo e a apoptose podem ser detectados após 48 horas de incubação no chip 2OC.

3.4. Absorção e metabolismo de drogas em chips de órgãos binários 2OC

As Figuras 5A e B mostram a evolução das concentrações de drogas em cada câmara ao longo do tempo. Uma rápida diminuição das concentrações de paracetaminofenol foi observada na câmara intestinal (Figura 5A), ao mesmo tempo que as concentrações de medicamentos detectados na câmara hepática aumentaram de forma correspondente (Figura 5B). Após 24 horas, paracetaminofenol de 3,93 ± 0,46 mM e 3,68 ± 0,41 mM foram detectados nas câmaras intestinal e hepática, respectivamente. Embora os processos de absorção sejam fáceis de observar, os processos metabólicos não são facilmente simulados, o que pode ser visto por uma diminuição insignificante das concentrações de paracetaminofenol, provavelmente devido a uma dose excessiva do medicamento. Mesmo que as concentrações totais do medicamento tenham uma tendência decrescente (Figura 5C), a tendência decrescente não é apenas devido à amostragem ou ao metabolismo do medicamento. Calculamos a quantidade teórica total de paracetamol não metabólico por 48 horas com referência às concentrações medidas por 32 horas. Quando não ocorre o metabolismo celular, a quantidade de paracetaminofenol deve ser de 3,16 ± 0,53 mol; No entanto, a quantidade realmente detectada foi de 2,95 ± 0,20 mol. Estes resultados sugerem que, mesmo com uma overdose de droga, o uso de nosso chip 2OC pode simular a absorção e os processos metabólicos da droga. A seguir. Detectamos o metabólito tóxico NAPQI, que não foi detectado no soro superior. Para descrever com precisão o processo de absorção de drogas no chip 2OC, calculamos os parâmetros dinâmicos de absorção de drogas do paracetaminofenol (APAP) usando o modelo NCA. Os cálculos de Tmax (tempo de pico), Cmax (concentração de pico) e AUC (área abaixo da curva) foram de 24 ±11,31 h, 3,98 ±0,59 mM e 157,73 ±14,88 h mM, respectivamente. No entanto, devido à diminuição mínima das concentrações de APAP, é difícil ajustar os parâmetros da cinética de eliminação do medicamento.

4. Discussão

Este estudo utilizou uma plataforma de chip multiórgão intestinal-fígado in vitro para avaliar a absorção de medicamentos e prever a toxicocinética e seus efeitos tóxicos. Construímos um sistema de chip intestinal-fígado acoplando dois órgãos independentes em uma plataforma de chip multi-órgão 2OC para reproduzir a absorção contínua de drogas do paracetaminofenol oral (APAP) e a consequente lesão aguda no fígado. No sistema 2OC, a taxa de absorção e a toxicidade do APAP são consistentes com os processos conhecidos de processamento in vivo. Estes resultados sugerem que os processos de absorção podem ser simulados em nosso modelo de 2OC e que efeitos tóxicos podem ser detectados na presença do cólito superior, o que é consistente com relatos anteriores. Nossas descobertas apoiam modelos de chip multi-órgão com múltiplos órgãos acoplados como modelos auxiliares para previsões de toxicidade de drogas no futuro. Construção intestinal com base na proporção de células epiteliais do intestino delgado humano para células copas, usando células Caco-2 e HT29-MTX-E12 (Chen et al., 2017; Tsamandouras et al., 2017). As esferas hepáticas são criadas com base na proporção da composição celular em um fígado saudável (Weiler-Normann e Rehermann, 2004). Com base em estudos anteriores, testamos a estrutura e a função hepática durante duas semanas de co-cultura. Sinalização de marcadores de THP-1 induzidos pelo HUVEC-T1 e CD31 (Newman, 1997), CD68 (Gao et al, 2018) e α-SMA (Chiabotto et al, 2021) do HHSC indica distribuição celular após 10 dias de cultura total. A acumulação de insuficiência hepática crônica (CLF) (Hopwood et al., 2006), níveis elevados de transportadores MRP2, BSEP e PGP (Rendic, 2021) e níveis elevados de albina (ALB) e uréia (UREA) (Baudy et al., 2020), respectivamente, explicam o aumento do transporte biliar, da excreção de medicamentos e da função anabólica. A insuficiência hepática crônica se acumulou na estrutura tubular da esfera 3D (Ramaiahgari et al., 2014), o que indica que a estrutura tubular preliminar se formou após sete dias de cultura. Construímos um chip intestinal-fígado baseado em microfluidos com base em nossos orgânicos intestinais e hepáticos (Marin et al., 2019; Maschmeyer et al., 2015). Outros modelos intestino-fígado sugerem que a área de superfície do órgão e a capacidade metabólica afetam a absorção e o metabolismo de medicamentos orais (Lee et al., 2017). A toxicidade hepática foi avaliada usando aspartina aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) (Meunier e Larrey, 2019). Após um total de 3 dias de cultivo, a tendência de aumento indica danos potenciais às células hepáticas, enquanto a tendência de redução da albina (ALB) pode ser devida a um fornecimento insuficiente de nutrientes, administração de medicamentos, malnutrição, redução da ingestão de proteínas e danos hepáticos (Belinskaia et al., 2020; Meunier e Larrey, 2019). Neste estudo, o sinalizamento do CYP3A4 foi ligeiramente melhorado, o que é consistente com os resultados de estudos anteriores, sugerindo que a atividade do CYP3A4 foi melhorada após a co-cultura intestinal-hepática (Chen et al, 2018b; Shinohara et al, 2021).

Como os estudos anteriores se concentraram principalmente no aumento da atividade metabólica de órganos hepáticos após a cocultura intestinal-hepática (Shinohara et al., 2021), focamos nas proteínas transportadoras MRP2, PGP e BSEP, que mediam a eliminação de substâncias exógenas das células hepáticas (Jetter e Kullak-Ublick, 2020). Nossos resultados mostram claramente que o modelo 2OC é capaz de simular a absorção de perigos tóxicos após a administração oral e que o soro é fácil de conservar para uso no monitoramento de biomarcadores humanos.

As razões para escolher essa concentração são as seguintes: 1) na concentração de teste, a integridade da barreira intestinal não será danificada; 2) O efeito tóxico da droga no fígado é maior do que no intestino. Embora a absorção do acetaminofenol (APAP) seja influenciada em grande parte pela evacuação do estômago (Toes et al., 2005), é absorvida principalmente pela difusão passiva do intestino delgado periférico (M′esza′ros et al., 2022). In vitro, altas concentrações de APAP demonstraram diminuir a vitalidade das células hepáticas (Bell et al, 2020). Em baixas doses, o APAP mostra efeitos tóxicos limitados; No entanto, quando overdose ou uso indevido de drogas, APAP pode causar danos celulares hepáticos agudos e graves (Bunchorntavakul e Reddy, 2018). A relação entre as concentrações de exposição e os efeitos tóxicos ao longo do tempo pode explicar o risco de toxicidade dependente do tempo e os mecanismos moleculares dos produtos químicos (Tennekes e Sánchez-Bayo, 2013). As concentrações de APAP são essenciais para refletir a exposição à droga; Assim, detectamos o transbordo do APAP (Bessems e Vermeulen, 2001; Krenkel et al., 2014; Makin e Williams, 1996).

O paracetaminofenol (APAP) tem boa biodisponibilidade oral (88%) porque é bem absorvido, atingindo um pico de concentração no plasma dentro de 90 minutos após a ingestão (Hodgman e Garrard, 2012). Em nosso estudo, a previsão do Tmax em nosso modelo 2OC (24 ± 11,31 h) foi maior do que nos dados clínicos (0,33-4 h) e em outros chips 2OC (6 h) (Marin et al., 2019). A APAP é absorvida rapidamente sob a dose terapêutica e diminui com o aumento da dose (Rosenberg et al., 1981). Na dose terapêutica, a meia-vida plasmática do APAP é de 1,5 a 2,5 horas; No entanto, detectamos um equilíbrio de concentração de fármaco em ambas as câmaras após 24 horas, consistente com os resultados de estudos anteriores. Rawlins et al. (1977) mediram as concentrações plasmáticas de voluntários após APAP oral (500, 1.000 e 2.000 mg) e mostraram um atraso no Tmax a 2.000 mg. Alguns relatos de casos mostram que a overdose de APAP pode levar a um atraso no pico de concentrações plasmáticas e a um prolongamento da absorção de APAP (Chiew et al., 2010; Graudins et al., 2010; Roberts e Buckley, 2008). Mazaleuskaya et al. (2015) concluíram que a meia-vida foi prolongada para 4-8 horas devido à alteração do metabolismo após a overdose de APAP. Escolheu-se uma dose de tóxicidade hepática não intestinal com concentrações de administração (paracetaminofenol, 4 mmol, 604,64 mg/l) de aproximadamente quatro a seis vezes a concentração plasmática de intoxicação (100-150 mg/l) e duas a três vezes a concentração plasmática letal em coma (200-300 mg/l) (Schulz et al., 2020). Como as concentrações tóxicas de acetaminofenol in vitro (Bell et al., 2020) são muito superiores às concentrações plasmáticas terapêuticas no corpo humano (5-25 mg/l) (Schulz et al., 2020), nenhum processo de eliminação do medicamento significativo foi observado em 48 horas em nosso estudo. As evidências complementares da farmacocinética (PK) sugerem que o modelo do chip precisa ser modificado, especialmente para estudar mais os métodos de conversão de dados in vitro e clínicos para a clínica, a fim de melhorar a relevância clínica dos resultados in vitro.

Finalmente, detectamos o efeito tóxico do nosso dispositivo sobre as células esféricas do fígado. A taxa de sobrevivência das células esféricas no chip 2OC foi ligeiramente melhorada em comparação com a placa de 96 buracos, refletindo especificamente as mudanças na toxicidade da droga com a concentração da droga e a exposição temporal. O consumo excessivo de paracetaminofenol (APAP) aumenta significativamente os níveis séricos de aspartina aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) (Acheampong e Thomas, 2016); Stockman， 2008）； No entanto, após 48 horas de exposição no modelo 2OC, os níveis de AST e ALT aumentaram ligeiramente. Enquanto isso, a redução da ALB sugere que a função metabólica do fígado é inibida e danos hepáticos graves ocorrem. Essa redução é consistente com um relatório anterior (Wu et al., 2022). Após a administração do medicamento, o sinal Ki67 (necessário para a divisão celular) das células mais externas diminuiu, indicando que a proliferação das células mais externas foi inibida. Inicialmente, detectamos esferas hepáticas bloqueadas após o tratamento da pancreatite aguda.

Em doses terapêuticas, o paracetaminofenol é convertido principalmente em metabólicos não tóxicos por acidificação e sulforização da glucose. O paracetaminofenol é oxidado pela enzima CYP2E1 e ativado como um inibidor da N-acetil aspartate aminotransferase (NAPQI), um produto tóxico. A NAPQI esgota a glutamine (GSH) e a converte em paracetaminofenol cisteína. Quando o GSH está abaixo de 30% dos níveis normais, o NAPQI não é mais reduzido, desencadeando uma resposta tóxica. Embora o NAPQI possa ser detectado em soros e órgãos animais (Russomanno et al, 2023; Zhang et al., 2018), mas ainda é difícil detectar esse intermediário instável em linhas celulares, exceto em células fígadas originais (Pingili et al., 2019) (Zhang et al., 2020). Como mencionado anteriormente (Zhang et al., 2020), apenas pequenas quantidades de paracetaminofenol são convertidas em NAPQI e têm uma meia-vida extremamente curta (Coles et al., 1988). Madsen et al., 2007). Pode ser desintoxicado rapidamente e facilmente em 130 ms por ligação ao GSH (Coles et al, 1988; Coles et al, 1988; Coles et al, 1988; Coles et al, 1988; Coles et al, 1988; Coles et al, 1988; Coles et al, 1988; Coles et al, 1988; Coles et al, 1988; Coles et Madsen et al., 2007), ou a redução de paracetaminofenol através de NADPH, adenina-dinucleótido de dihidronicinamida e redutase (Zhang et al., 2020), dificultando a detecção de NAPQI em seus modelos in vitro (Zhang et al., 2020). A ligação à proteína APAP ocorre após o esgotamento da glutaptina (GSH), um evento precoce no mecanismo de toxicidade hepática (Jaeschke et al., 2014; McGill et al., 2013). Como modelo in vitro alternativo, esgotamento de GSH (Leclerc et al., 2015), capacidade oxidativa (Geib et al., 2021); Leclerc et al., 2015), ligação à proteína covalente (Geib et al., 2019, 2021); Pierce et al., 2002) e informações toxicas in vitro obtidas usando modelos de biologia sistemática (Leclerc et al., 2015) podem ser métodos alternativos para rastrear ou sugerir a formação e acumulação de NAPQI. A NAPQI liga-se às proteínas mitocondriais para induzir a acilação das proteínas, o que pode levar à necrose celular hepática ou ao estresse oxidativo e à disfunção mitocondrial, que eventualmente resulta em apoptose e danos hepáticos (Bessems e Vermeulen, 2001; Krenkel et al., 2014; Makin e Williams, 1996; Saito et al., 2010). Durante a ocorrência de toxicidade hepática induzida pela pancreatite aguda (APAP), as células hepáticas apresentam disfunção mitocondrial e estresse oxidativo (Shan et al., 2018; Ye et al., 2018). Após o tratamento, a diminuição do sinal TMRE no modelo de fígado sugeriu que o potencial da membrana mitocondrial das células hepáticas (especialmente as células laterais) estava reduzido e a função mitocondrial foi afetada. O potencial da membrana mitocondrial indica mudanças na atividade mitocondrial e alteração do estágio mitocondrial (Vianello et al., 2023). Nos estágios iniciais da insuficiência hepática aguda, o potencial da membrana mitocondrial diminui, levando a alterações morfológicas mitocondriais e afetando a função mitocondrial, um sinal inicial de dano celular hepático (Li et al., 2011; Umbaugh e outros, 2021). Considerando que o estresse oxidativo causado pela insuficiência hepática aguda danifica a dobragem das proteínas e desencadeia o estresse da endometria (Ferret, 2001; Ye et al., 2018), usamos CellROX para localizar sinais de oxigênio ativo e observamos uma distribuição significativa de sinais de oxigênio ativo no grupo de insuficiência hepática aguda. Estes resultados sugerem que mudanças no potencial da membrana mitocondrial e no estresse oxidativo celular podem ser detectadas em modelos de fígado depois de uma overdose de insuficiência hepática aguda simulada com um chip 2OC.

A apoptose hepática ocorre nos estágios iniciais da insuficiência hepática aguda (Possamai et al, 2013). A insuficiência hepática aguda (induzida pela APAP) resulta no esgotamento da glutatina (GSH), que desencadeia vias e processos tóxicos mitocondriais que convertem o precursor da cysteine aspartate protease 3/7 em cysteine aspartate protease ativamente fissada (Baek et al., 2016). A cisteína aspartina protease-3 é um agente-chave da apoptose, cuja forma precursora é fissada antes de ser convertida em uma forma ativa (Fernandes-Alnemri et al., 1994). O gene inibidor do tumor p53 regula a apoptose através da ativação da transcrição (Arakawa, 2005). A toxicidade hepática induzida pela APAP pode levar a um leve aumento da regulação da p53 (Chen et al., 2018a). Após a administração do APAP, o sinalizamento da proteína cisteína aspartatase-3 fissada aumentou significativamente e o sinalizamento p53 foi ligeiramente aumentado, indicando que o APAP induziu sinalização de apoptose celular.

No entanto, é inegável que os modelos animais contribuíram significativamente para a compreensão e progresso da medicina moderna, especialmente nas últimas décadas, para avaliações de segurança de medicamentos e produtos químicos que podem ser insubstituíveis por modelos in vitro alternativos. Embora esses novos modelos tenham desempenhado e continuarão a desempenhar um papel importante na pesquisa biomédica e regulatória, permitem estudar uma série de efeitos de uma substância e oferecem alta sensibilidade sem interferência de outros fenômenos biológicos (Kaplan et al, 2024). Por outro lado, deve-se enfatizar que o modelo 2OC certamente não pode substituir os modelos biológicos existentes, mas sim como uma ferramenta de pesquisa que fornece insights específicos com antecedência para reduzir o número de animais necessários para a triagem de medicamentos. Nossos resultados sugerem que o modelo 2OC pode usar sondas fluorescentes para medir a absorção de drogas e detectar mudanças de sinalização associadas a múltiplas toxicidades, demonstrando a possibilidade de chips de múltiplos órgãos como evidências auxiliares para detectar simultaneamente a eficácia / toxicidade e o potencial farmacocinético da droga.

5. Conclusões

Construímos um intestino-fígado.Chip de órgão duploSistema e avaliar seus efeitos tóxicos simulando o processo de dano hepático agudo após overdose de paracetaminofenol (APAP). Os órgãos intestinais foram construídos através da co-cultura de células Caco-2 e HT29-MTX-E12 e os esferoides hepáticos foram construídos com células THP-1 induzidas por HepG2, HUVEC-T1, PMA e HHSC. Em chipsets multi-órgão, a expressão de PGP, MRP2 e CYP3A4 nos órgãos hepáticos foi ligeiramente melhorada. Após obter a curva concentração-tempo do APAP em duas câmaras, os parâmetros Tmax, Cmax e AUC foram combinados com o método NCA. O tratamento APAP aumentou os níveis de biomarcadores tóxicos do fígado AST e ALT, reduziu a secreção de albina (ALB), inibiu a proliferação celular, aumentou o sinalização de oxigênio ativo (ROS), reduziu o potencial da membrana mitocondrial, ativou a caspase-3 e aumentou o sinalização de p53. Este estudo fornece evidências complementares para a aplicação de chips de órgão em estudos de toxicidade farmacêutica, ao mesmo tempo que detecta conteúdos de drogas e respostas toxicas, oferecendo potencial para prever as propriedades farmacocinéticas e toxicológicas de compostos candidatos.