Tanques de fermentação de aço inoxidável de laboratórioComo equipamento central para a cultura de microbios, síntese de metabólicos e pesquisa de reações biológicas, com as vantagens de resistência à corrosão, fácil limpeza e precisão de controle de temperatura, é amplamente utilizado em microbiologia, bioengenharia, ciência dos alimentos e outras áreas. Suas normas operacionais determinam diretamente a estabilidade do sistema de fermentação e a repetibilidade dos experimentos, enquanto o processo de esterilização é uma premissa fundamental para evitar a poluição gerótica e garantir o sucesso dos experimentos. Este artigo examinará detalhadamente o processo operacional padrão e os métodos de esterilização do núcleo de tanques de fermentação de aço inoxidável de laboratório para fornecer orientações práticas para o pessoal do experimento.
Processo de operação do tanque de fermentação de aço inoxidável de laboratório
O funcionamento do tanque de fermentação de aço inoxidável de laboratório deve seguir a lógica de ciclo fechado de "preparação - depuração - fermentação - conclusão", o núcleo é o controle preciso da temperatura, pH、 Parâmetros-chave como oxigênio dissolvido e agitação para satisfazer as necessidades metabólicas e de crescimento dos micróbios.
1) Preparação pré-operacional: Fundamentos experimentais para a construção da prisão
Inspeção do equipamento: verificar um por um o estado do componente central do tanque de fermentação - o tanque e os vedantes não estão danificados ou vazados; Rotação flexível do remo de agitação sem cartões; Sensores de temperatura, eletrodos de pH, eletrodos de oxigênio dissolvido e outras sondas limpas sem arranhões; Tubos de entrada de ar, tubos de suplemento, tubos de escape e outros tubos sem obstrução; Válvulas de segurança, medidores de pressão e outros componentes de segurança estão dentro do período de validade da verificação. Verifique também se o equipamento auxiliar (por exemplo, compressor de ar, refrigerador de água, bomba periférica, panela de esterilização) está funcionando corretamente.
Preparação do material: de acordo com a fórmula de fermentação, a formulação precisa do meio de cultura para garantir que todos os componentes (fontes de carbono, nitrogênio, sal inorgânico, oligoelementos, etc.) sejam pesados com precisão e dissolvidos adequadamente para evitar aglomerações. Os componentes fáceis de oxidar ou sensíveis ao calor devem ser preparados separadamente e adicionados por filtração estéril (membrana de filtro de 0,22 μm). Prepare a suspensão da espécie para garantir que a atividade da espécie seja adequada e a concentração atenda aos requisitos de vacinação.
Conexão e vedação de tubos: Conexão de tubos por processo de fermentação - tubos de entrada conectam o sistema de ar estéril, tubos de escape para o dispositivo de condensação e o sistema de tratamento de gases de escape, tubos de suplemento conectam garrafas de suplemento estéril, tubos de amostragem equipados com válvulas de amostragem estéril. Após a ligação, as porcas de interface são fechadas para assegurar uma vedação firme (verificável por meio de testes de pressão posteriores) e evitar vazamentos de gás ou invasões geróticas durante a fermentação.
(2) Equipamento de depuração: parâmetros de configuração precisa
Descarga vazia: conectar a fonte de energia total do tanque de fermentação, iniciar o sistema de controle, em seguida, testar o sistema de agitação (ajustar a velocidade de rotação para 50-100 rpm, observar a estabilidade de funcionamento do palo de agitação), o sistema de controle de temperatura (configurar 37 ° C, verificar se o módulo de aquecimento ou refrigeração está normalmente iniciado e parado), o sistema de controle de pH (calibrar o eletrodo de pH com um tampão padrão para garantir o erro de leitura ≤ ± 0,05), o sistema de controle de oxigênio dissolvido (calibrar o eletrodo de oxigênio dissolvido, observar se as mudanças de leitura são sensíveis após a entrada no ar).
Preenchimento do meio e parâmetros pré-definidos: o meio preparado é injetado no tanque de fermentação através de um funil estéril, o volume de enchimento é controlado em 50% -70% do volume eficaz do tanque (para evitar derramamento de espuma ou falta de oxigênio dissolvido durante o processo de fermentação). Após o fechamento da porta de alimentação, os parâmetros principais são pré-definidos no sistema de controle: temperatura (por exemplo, bactérias 37 ° C, fungos 28 ° C), velocidade de agitação (definida de 50-300 rpm de acordo com as necessidades da bactéria), volume de ventilação (geralmente 0,5-2 vvm, ou seja, 0,5-2 volumes de ar estéril por hora por meio de cultura), pH (por exemplo, bactérias 7,0-7,2, levedura 4,5-5,5) e estratégia de suplementação (tempo de suplementação, taxa de suplementação).
Operação de fermentação: monitoramento e regulação dinâmica
Operação de vacinação: usar a técnica de operação estéril para a vacinação - limpar e desinfetar a boca de vacinação com álcool, depois de abrir a boca de vacinação, injete rapidamente a suspensão bacteriana no tanque e gire a porca imediatamente após a injeção. O processo de vacinação deve ser rápido e regular para evitar a introdução de gerígenas durante longos períodos de exposição ao ar.
Monitoramento e ajuste de parâmetros: a temperatura é registrada a cada 1 hora durante o início da fermentação. pH、 Parâmetros como oxigênio dissolvido e velocidade de agitação podem ser estendidos para 2-4 horas após a estabilização. Ajuste dinâmico de acordo com as mudanças de parâmetros: quando a temperatura desvia dos valores definidos, ajustado através de módulos de aquecimento ou refrigeração; Adicionar amônia estéril ou solução de NaOH quando o pH diminui e ácido clorhidrico estéril ou ácido orgânico quando o pH aumenta; Quando o oxigênio dissolvido é muito baixo, pode aumentar a velocidade de agitação, aumentar o volume de ventilação ou entrar em oxigênio puro; Quando aparecer uma grande quantidade de espuma, adicione manualmente o desespumante estéril ou inicie o sistema automático de desespuma.
Amostragem e teste: amostragem regular de acordo com as necessidades experimentais, antes da amostragem, desinfete a válvula de amostragem com álcool e solte uma pequena quantidade de líquido de fermento para lavar o tubo e coletar a amostra. As amostras precisam detectar a concentração bactérica (como OD600), o conteúdo de metabólicos (como cromatografia líquida de alta eficiência), a composição residual do meio de cultura, etc., para fornecer base para o julgamento do processo de fermentação e ajuste de parâmetros.
Finalização da fermentação: regulamentação do tempo de parada e limpeza
Operação de parada: quando a fermentação atingir o ponto final predefinido (por exemplo, pico de concentração bactérica, produção máxima de metabólitos), desligue o módulo de aquecimento / refrigeração, o sistema de agitação e o sistema de ventilação antes de cortar a fonte de energia total. Abra lentamente a válvula de escape para descarregar a pressão, depois que a pressão dentro do tanque cai para a pressão normal, abra a saída para coletar o líquido fermentado.
Limpeza preliminar: esvaziar o líquido residual do tanque em tempo útil, lavar o interior do tanque com água da torneira, agitar a pá e a superfície da sonda para remover a visível adesão bacteriana e os resíduos do meio de cultura. No sistema de tubulação, a água da torneira de alta pressão pode ser lavada para garantir que não haja líquido residual.
Processo de esterilização de tanques de fermentação de aço inoxidável de laboratório
A poluição gerótica é uma das principais causas do fracasso do experimento de fermentação, a esterilização do tanque de fermentação de aço inoxidável de laboratório precisa seguir o princípio de "cobertura completa, eliminação completa", o núcleo para o tanque, o meio de cultura, a tubulação e os acessórios para a esterilização, o método comum é a esterilização térmica úmida (esterilização a vapor de alta pressão), cenários especiais podem ser combinados com a esterilização térmica seca ou a esterilização química.
Preparação pré-esterilização: detecção e pré-tratamento
Inspeção do equipamento e da tubulação: confirme que a vedação do tanque de fermentação (como o anel de vedação de silicone) não envelhece e a interface da tubulação não está solta; Verifique se o nível de água da panela de esterilização está em conformidade com o padrão, a válvula de segurança e a válvula de escape funcionam normalmente. Os componentes que não são resistentes a altas temperaturas (por exemplo, eletrodos parciais de pH, eletrodos de oxigênio dissolvido) devem ser removidos antecipadamente e substituídos por bloqueios específicos para esterilização ou por tratamento estéril separado.
Pré-tratamento de tanques e tubulações: lavar os tanques e tubulações com água deionizada para remover os resíduos de detergente ou impurezas. Depois de injetar o meio no recipiente, abra a paleta de agitação e agite durante 5-10 minutos para garantir que o meio seja distribuído uniformemente e evite que os aglomerados locais afetem o efeito de esterilização.
(2) Método de esterilização do núcleo: operação de esterilização térmica úmida (comum)
A esterilização térmica úmida usa a alta temperatura (121 ° C) e a alta umidade do vapor de alta pressão para matar micróbios e bactérios, aplicável a tanques, meios de cultura, tubulações e outros componentes resistentes a altas temperaturas, o processo específico é o seguinte:
Fechamento e entrada de ar: Feche todas as aberturas do tanque de fermentação (entrada, amostragem, saída) e gire as porcas de interface para garantir a vedação do tanque. Conecte o tubo de escape do tanque de fermentação, o tubo de entrada de ar à panela de esterilização ou ao gerador de vapor de esterilização especial, abra a válvula de entrada de ar para entrar lentamente no vapor e exclua o ar frio do tanque e da tubulação (os resíduos de ar frio podem causar a temperatura local insuficiente e a esterilização incompleta).
Aumento de pressão e isolamento: após o tubo de escape continuamente evacuar vapor uniforme (sem mistura de ar frio), feche a válvula de escape e comece a aumentar a pressão. Quando a pressão no tanque aumenta para 0,1 MPa (pressão superficial), a temperatura atinge 121 ° C, mantenha a pressão e a temperatura por 30-60 minutos (de acordo com o ajuste da composição do meio de cultura: estenda para 60 minutos quando contém amido, proteína e outros componentes difíceis de esterilizar, o meio de cultura comum é de 30 minutos). A pressão e a temperatura são monitoradas de perto durante a esterilização e, caso a pressão caia, o vapor deve ser reabastecido oportunamente.
Redução de pressão e resfriamento: após a esterilização, abra lentamente a válvula de escape para descarregar a pressão, quando a pressão cair para 0,02 MPa, abra o sistema de resfriamento (como refrigerador de água) para resfriar o tanque. Quando a temperatura dentro do tanque cai para 40-50 ° C (evitar que a vacinação a temperatura excessiva cause a inativação da bactéria e que a baixa temperatura cause a coagulação do meio de cultura), a pressão cai para a pressão normal, desligue o sistema de resfriamento e prepare a vacinação.
3) Método de esterilização auxiliar: adaptação a cenários especiais
Esterilização térmica seca: para componentes que não podem ser esterilizados por calor úmido (por exemplo, colheres de amostragem de metal, acessórios dentro da mesa de operação estéril), coloque-os em uma caixa de esterilização térmica seca, esterilize-os por 2-3 horas a 160-180 ° C e arrefeca-os naturalmente a temperatura ambiente.
Esterilização química: para tubos ou superfícies que não são resistentes a altas temperaturas (por exemplo, tubos de plástico parciais, sondas de sensores), limpe ou mergulhe com 75% de álcool por 30 minutos, em seguida, limpe com água salina estéril para remover os resíduos de álcool para evitar a inibição da espécie de reagentes químicos.
Esterilização do sistema de ar estéril: o ar que entra no processo de fermentação precisa ser estéril e pode ser tratado por esterilização a alta temperatura (aquecimento do ar até 121 ° C por 30 minutos) ou filtragem de filtro (uso de filtro estéril de 0,22 μm) para garantir que o ar que entra no tanque seja livre de gerígenas.
Verificação e manutenção após a esterilização
Verificação do efeito da esterilização: pode ser usado "método de cultura em branco" para verificar - após a esterilização, não vacinar, colocar o tanque de fermentação na temperatura de configuração da fermentação durante 24-48 horas, se o meio de cultura não é turbulento, o crescimento de estéreos, indicar a esterilização qualificada; Indicadores biológicos também podem ser usados (por exemplo, Bacteria Bacteria lipophila), indicadores de cultura após a esterilização, se os indicadores não mudarem de cor, a esterilização é qualificada.
Reinicialização e conservação do componente: após a esterilização, a sonda removida antecipadamente (por exemplo, pH, eletrodo de oxigênio dissolvido) é reinicializada após lavagem com água salina fisiológica estéril para garantir a vedação da interface. Os tanques de fermentação não usados imediatamente devem ser mantidos secos, podem entrar no ar estéril para secar o interior e fechar todas as aberturas após a reserva.
Precauções essenciais para operação e esterilização
Prioridade de segurança: durante o processo de esterilização é estritamente proibido abrir o tanque ou a panela de esterilização sem autorização, a despressão precisa operar lentamente para evitar que a queda de pressão provoque a ebulição do meio de cultura; Ao operar o sistema de agitação, é proibido colocar mãos ou ferramentas dentro do tanque para evitar danos mecânicos.
Operação estéril durante todo o processo: vacinação, amostragem, suplementos e outros aspectos devem ser realizados no banco de operação estéril, o operador deve usar roupas estériles, luvas e máscaras para evitar a introdução artificial de géreos.
Manutenção regular do equipamento: verificar mensalmente o envelhecimento do selo do tanque de fermentação e substituir-o oportunamente; Calibrar sensores de temperatura, eletrodos de pH, eletrodos de oxigênio dissolvido e medidores de pressão a cada 3-6 meses para garantir a precisão dos parâmetros de detecção; Limpe oportunamente o tanque após a esterilização para evitar que os resíduos do meio corroam a parede interna do aço inoxidável.
Registro completo dos parâmetros: registro detalhado da temperatura durante a operação, pH、 Parâmetros como oxigênio dissolvido, velocidade de agitação e informações como pressão, temperatura e tempo de isolamento da esterilização fornecem base para repetição de experimentos e resolução de problemas.
Em resumo,Tanques de fermentação de aço inoxidável de laboratórioO processo de operação e esterilização deve seguir os princípios fundamentais de "controle preciso, segurança estéril". O processo operacional padronizado garante a estabilidade dos parâmetros de fermentação e melhora a repetibilidade dos experimentos; Um rigoroso processo de esterilização evita a contaminação gerótica da fonte e garante o sucesso dos experimentos. Através do conhecimento especializado dos processos e considerações acima, o valor experimental do tanque de fermentação pode ser aproveitado ao máximo para fornecer apoio confiável à pesquisa microbiológica e às experiências de bioengenharia.