A PCR por fluorescência em tempo real (qPCR) monitora o processo de amplificação de DNA em tempo real através de sinais de fluorescência, e sua interpretação de dados requer análises integrais em combinação com curvas de amplificação, valores de Ct e curvas de fusão.

Pontos essenciais da interpretação de dados

Análise de curva de expansão

A curva de amplificação normal deve ser do tipo "S" e incluir períodos de base, períodos exponenciais e períodos de plataforma. Se a curva aparecer em um período precoce (amplificação não específica) ou em um período tardio de plataforma (extinção de fluorescência), pode indicar a degradação do dímero inicial ou do reagente. Por exemplo, um laboratório com uma sonda expirada causou uma redução de 30% na eficiência da amplificação da amostra.

Determinação do valor Ct

O valor Ct (número de ciclos limiar) reflete a quantidade inicial do modelo e deve garantir que caia dentro do intervalo linear da curva padrão (geralmente 15-35 ciclos). Caso o valor de Ct seja anormalmente baixo (<15), pode haver contaminação. Se for elevado (>35), a degradação da amostra ou a eficiência da extração devem ser resolvidas. Um teste clínico descobriu que, após armazenar amostras de sangue por mais de 48 horas, o valor de Ct foi atrasado em média por três ciclos.

Verificação da curva de fusão

Curvas de fusão de pico único (valores Tm consistentes) indicam amplificação de especificidade, com picos duplos ou múltiplos sugerindo dímeros iniciais ou produtos não alvo. Por exemplo, na detecção do método SYBRGreen, se a temperatura de fusão se desviar do esperado (por exemplo, o produto alvo Tm = 82 ° C, o pico de 78 ° C realmente aparece), é necessário redesenhar o primer.

Perguntas frequentes e soluções

Sem amplificação ou atraso de amplificação

Causas: degradação do modelo, falha do precursor, atividade enzimática insuficiente.

Solução: extrair novamente o DNA/RNA, usando precursores frescos e reagentes de fragmentase para evitar o congelamento repetido.

Aumento não específico

Causa: O desenho do introdutor é ruim e a temperatura de cozimento é muito baixa.

Solução: otimizar o introdutor (conteúdo de GC de 40-60%, comprimento de 18-22bp), aumentar a temperatura de cozimento de 5 ° C.

Repetibilidade fraca

Causa: erro de amostragem, flutuação de temperatura do instrumento.

Resolução: Calibre o instrumento regularmente (por exemplo, precisão de temperatura ± 0,2 ° C) usando amostragem de escopeta.

Anormalidade do sinal fluorescente

Causa: Falta de corante de referência ROX, filtro errado.

Solução: Complementar o corante ROX para verificar o sistema de vias ópticas do instrumento.

Recomendações de controle de qualidade

Cada experimento definiu um controle negativo (sem modelo) e um controle positivo (modelo de concentração conhecida).

O valor da curva padrão R² deve ser ≥ 0,99 e a eficiência de amplificação permanece entre 90% e 110%.

Limpe regularmente a via óptica do instrumento para evitar que a poeira afete a detecção de fluorescência.

A análise sistemática da morfologia da curva de amplificação, distribuição de valores Ct e características da curva de fusão, combinada com medidas rigorosas de controle de qualidade, pode melhorar significativamente a confiabilidade e a repetibilidade dos dados de qPCR.