O princípio técnico e o processo operacional da impressora de proteínas multicanal WesternBlotting dependem principalmente de sua capacidade de detecção de proteínas eficiente e precisa. A impressão de proteínas (WesternBlot) é uma técnica experimental para detectar e analisar a expressão de proteínas específicas, amplamente utilizada em áreas como biologia molecular e pesquisa médica.
Aqui estão os princípios técnicos e processos operacionais da impressora de proteína doméstica multicanal:
Princípios técnicos
O princípio básico da impressão de proteína é separar a proteína da amostra por tamanho molecular por eletroferese em gel e transferir a proteína isolada para a membrana por meio de uma transmembrana. Em seguida, a presença e a quantidade de expressão da proteína são detectadas através da ligação da membrana a anticorpos específicos.
A impressora de proteína multicanal melhora principalmente a eficiência experimental através do processamento paralelo de vários canais de amostra em um único instrumento. Seus principais princípios técnicos incluem:
Separação de proteínas:
Eletroforese em gel (SDS-PAGE): As proteínas em amostras são separadas por eletroferese em gel de poliacrilamida, onde as proteínas de menor peso molecular migram mais rápido no campo elétrico e as proteínas maiores migram mais lentamente, o que permite a separação por tamanho.
Transferência de proteínas:
Transferência de membrana: a transferência de proteínas isoladas do gel para uma membrana (geralmente uma membrana de PVDF de poli-difluoroetileno ou de celulose nitrata) por meio de transferência elétrica (eletroforese). A proteína na membrana é fixada em um local específico.
Teste de proteínas:
Incubação de anticorpos: através do uso de anticorpos específicos (geralmente anticorpos contra a proteína alvo), os anticorpos se ligam à proteína alvo na membrana.
Reações quimicamente luminescentes ou colorificantes: anticorpos secundários marcados com enzimas se ligam à proteína alvo e geram sinais através de reações quimicamente luminescentes ou colorificantes para detectar a presença e a expressão de proteínas através de sistemas de imagem.
Tecnologia multicanal:
A impressora de proteína multicanal é capaz de processar vários canais de amostra ao mesmo tempo durante o mesmo processo experimental, com base na impressão de proteína de canal único tradicional. Isto é alcançado através de múltiplos buracos de amostra e operações paralelas, melhorando a eficiência do experimento e a comparabilidade dos dados.
Processo operacional
O processo operacional de uma impressora de proteína doméstica multicanal geralmente inclui as seguintes etapas principais:
1. Preparação de amostras
Recolha amostras de células ou tecidos a serem testadas.
Utilize o tampão de fissão para quebrar as células e extrair as proteínas.
Quantificar a proteína extraída para garantir que a quantidade de proteína seja igual a cada amostra.
2.SDS-PAGE eletroferese
Para preparar o gel de poliacrilamida, geralmente usando o gel SDS-PAGE, o SDS (sulfato de sódio de docealquilo) é usado para destruir a estrutura da proteína, deixá-la carregada negativamente e separada por tamanho molecular.
A amostra é carregada em gel e eletroforese no campo elétrico para separar proteínas de diferentes pesos moleculares.
3. Transformação
Transferir a proteína do gel para a membrana PVDF ou para a membrana de celulose nitrata. O processo de transformação é geralmente realizado por transferência elétrica.
Utilize instrumentos de transmembrana (como unidades de transmembrana em impressoras de proteínas multicanais) para ajustar parâmetros como corrente, tensão, tempo de transferência e outros para garantir a transferência eficiente e uniforme de proteínas para a membrana.
4. Bloqueio
Tratar a membrana com um líquido fechado, como leite em pó desgorduro a 5% ou solução de BSA, para fechar os locais de ligação não específicos e evitar que os anticorpos se liguem a outras partes da membrana.
Incubação de anticorpos
Incubação anti-monoclonal: a membrana é colocada em uma solução anti-monoclonal, geralmente um anticorpo primário específico contra a proteína alvo. O tempo de incubação varia de acordo com as características dos anticorpos pode ser de 1 hora até a noite.
Incubação secundária: Incubação com anticorpos secundários marcados por enzimas (como a peroxidase HRP) ou outras moléculas detetáveis para aumentar o sinalizamento.
6. Detecção de luminosidade química
Reagindo com um substrato quimicamente luminescente, como um reagente ECL, a enzima HRP cataliza a luminosidade do substrato.
Capture sinais luminosos usando sistemas de imagem, como sistemas de imagem de emissão química, para gerar imagens de detecção de proteínas.
O design multicanal da impressora de proteínas multicanal permite a captura de sinais em várias amostras simultaneamente, aumentando a eficiência.
7. Análise de dados
Os níveis de expressão das proteínas são analisados de acordo com o brilho e o tamanho das faixas detectadas. A força da faixa é proporcional à expressão da proteína alvo.
Use o software para realizar uma análise quantitativa das faixas e comparar-as com o padrão de proteína para calcular a expressão relativa das proteínas.
Vantagens e características
Operação paralela multicanal: pode processar várias amostras simultaneamente para melhorar a produtividade e a comparabilidade dos dados.
Alto grau de automação: redução do erro humano através do controle automático do transmembrana, incubação de anticorpos, lavagem e outras etapas.
Alta sensibilidade e alto fluxo: adequado para a detecção de proteínas de baixa abundância e capaz de processar grandes quantidades de amostras.
Ampla gama de aplicações: pode ser aplicado em vários experimentos, como análise de expressão de proteínas, verificação de especificidade de anticorpos, estudo de interações proteína-proteína, etc.
conclusão
A impressora de proteínas doméstica multicanal melhora significativamente a eficiência e a precisão dos experimentos de impressão de proteínas através de um processo operacional eficiente e automatizado. Ele oferece aos pesquisadores ferramentas de detecção de proteínas mais rápidas e de maior fluxo, mostrando vantagens significativas, especialmente quando é necessário processar várias amostras simultaneamente.