Sequenciamento de DNA com tecnologia de microfluidos baseada em gotas

A tecnologia de geração de gotas permite aos pesquisadores realizar pesquisas em grande escala com volumes mínimos de amostra, uma abordagem que pode tornar o sequenciamento de DNA mais eficiente e econômico. Além disso, pode ajudar a identificar pequenas variações intracelulares associadas ao diagnóstico de câncer. Este artigo discute a aplicação da geração de gotas na análise de DNA e mostra a configuração básica necessária para realizar experimentos com microfluidos de gotas.

1 Oportunidades e desafios da análise de DNA

Os cientistas analisam o DNA para identificar mutações cancerígenas, caracterizar anticorpos humanos e diferenciar micróbios. A análise de DNA envolve várias técnicas, incluindo o uso de uma matriz de sondas de sequência conhecida ou a utilização de plataformas de sequência de próxima geração (NGS) para sequenciar o genoma [1].

A plataforma NGS usa uma matriz de chips para realizar análises paralelas em larga escala que podem detectar centenas de milhões de moléculas simultaneamente, reduzindo custos e aumentando eficiência.

No entanto, a capacidade analítica das matrizes de chips tradicionais é limitada e requer sistemas adicionais de processamento de fluidos e mistura de reagentes, aumentando a complexidade do processo experimental e limitando o rendimento total. Para reduzir o custo de sequenciamento por base, muitas vezes é necessário processar várias amostras em paralelo, e a marcação de código de barras, embora possa aliviar parcialmente o problema, aumenta o tempo do processo experimental [1].

2 Tecnologia de microfluidos baseada em gotas

A tecnologia de gotas de microfluido é a geração de gotas discretas usando fases insolúveis (geralmente aquáticas e oleosas) e controlando a geração de gotas com alta velocidade e precisão através de bombas de microfluido. As principais vantagens incluem:

• Necessidade de baixo volume de amostra

• Alto nível de automatização

• Alto fluxo

• Baixo custo

Os dispositivos de microfluidos podem controlar o volume de fluido com rapidez e precisão, aumentando o rendimento de análise de DNA. Por exemplo, a tecnologia de microfluidização de gotas permite a geração e classificação de milhares de gotas por segundo [1].

Cada gota é uma câmara de reação independente e é adequada para aplicações como contagem molecular por PCR digital, triagem de cristalização de proteínas e análise de expressão genética. O número de reações pode aumentar à medida que a taxa de geração de gotas aumenta, enquanto a diminuição do volume de gotas reduz o consumo de reagentes, tornando os experimentos mais flexíveis.

No geral, a tecnologia pode realizar centenas de milhões de reações com muito pouco consumo de reagentes, melhorando significativamente a eficiência experimental e reduzindo custos. No entanto, ao contrário da detecção de ponto fixo baseada em uma matriz de chips, as gotas fluem por um canal de microfluidos e não podem marcar os resultados através da informação de localização, o que requer métodos adicionais de marcação [1].

3 Sequenciamento de genoma de célula única de alto fluxo

As técnicas de sequenciamento tradicionais geralmente são difíceis de detectar pequenas variações no genoma, por isso os cientistas usam o sequenciamento de todo o genoma de uma única célula para identificar variações de número de cópias e variações de um único nucleótido.

A tecnologia de microfluidos permite a sequência de células únicas de alto fluxo e escalável. Por exemplo, um estudo utilizou a técnica de marcação de código de barras para analisar o DNA genômico amplificado de células cancerosas individuais. O método é capaz de detectar células com mutações patogênicas durante o período de remissão do câncer e revelar o complexo processo evolutivo de clonagem de tumores com leucemia mielial aguda (AML), informações que os métodos de sequenciamento tradicionais não podem capturar [3]. Assim, a técnica promete melhorar a precisão da análise da heterogeneidade do genoma do câncer e otimizar estratégias de tratamento personalizadas [3].

4 Como começar o experimento?

A tecnologia de microfluidização de gotas oferece uma análise de DNA de alto fluxo e baixo custo. Se você quiser realizar experimentos relevantes, abaixo estão os equipamentos básicos necessários:

2-3 bombas de microfluidos(ou uma bomba com 2-3 canais, como uma bomba 4U) - controla o fluxo da fase contínua (fase de óleo) e da fase dispersa (fase de água). Recomenda-se a utilização de bombas de pressão 4U ou de 2 a 3 bombas de injeção ExiGo com microfluidos, onde as bombas de pressão 4U podem ser controladas independentemente em 4 canais para um controle de fluxo estável e preciso.

• Dois a três.Sensores de fluxoMonitoramento em tempo real do fluxo de óleo e água para garantir a estabilidade do fluido.

• Micro-Fluid Chip- Gerar gotas e garantir o controle do tamanho das gotas.

• Modificação química de superfície de canal estávelAumentar a estabilidade das gotas.

• surfactanteEstabilizar a interface de óleo e água para melhorar a estabilidade das gotas.

• fase óleoAumentar a estabilidade das gotas.

• Tubos- Conecte a bomba e o chip de microfluido.

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Referências

1. Abate, Adam R et al. “Análise de sequência de DNA com microfluidics baseado em gotas.” Laboratório em um chip vol. 13,24 (2013): 4864-9. Doi: 10.1039/c3lc50905b

2. Pellegrino, Maurizio et al. “Sequenciamento de DNA de célula única de alto rendimento de tumores de leucemia mielóide aguda com microfluidica de gotas.” Pesquisa do genoma vol. 28,9 (2018): 1345-1352. Doi:10.1101/gr.232272.117

3. Sohrabi, S., & Moraveji, M. K. (2020). Microfluidica de gotas: fundamentos e suas aplicações avançadas. RSC Advances, 10(46), 27560-27574.