O Analisador de PCR Quantitativo de Fluorescença monitora as mudanças no sinal de fluorescência em tempo real, combinando o valor de Ct com a análise da curva padrão para alcançar a quantificação precisa dos genes. Seus princípios fundamentais e etapas de implementação são os seguintes:

Princípios básicos

A adição de grupos fluorescentes (por exemplo, corantes SYBRGreen ou sondas TaqMan) ao sistema de reação de amplificação de PCR permite que a intensidade do sinal fluorescente varie sincronicamente com a quantidade de produto amplificado. Cada ciclo de PCR concluído, o instrumento capta um sinal fluorescente e gera uma curva de amplificação. Determine o número de ciclos (valores Ct) quando o produto amplificado atinge o limiar, definindo um limiar de fluorescência (geralmente 10 vezes o desvio padrão do sinal de base). O valor de Ct é negativamente associado ao número de modelos iniciais, isto é, quanto maior o número de modelos iniciais, menor o valor de Ct.

Passos de implementação

Construção de curva padrão: diluição gradiental com padrões de concentrações conhecidas, como DNA plasmódico purificado ou RNA transcrito in vitro, para amplificação de PCR com padrões de concentrações diferentes como modelo. Use o logaritmo do número de cópias padrão como coordenada horizontal e o valor Ct como coordenada longitudinal para desenhar a curva padrão. Quando as concentrações do padrão estão entre 10² e 10¹Quando Quando o número de cópias está variado, a concentração do modelo geralmente apresenta uma boa relação linear com o valor de Ct (coeficiente de correlação R² > 0,99), garantindo quantificações precisas nessa faixa.

Detecção de amostras desconhecidas: a amostra desconhecida é sincronizada com o padrão e a fórmula da curva padrão é substituída por seu valor de Ct para calcular o número de cópias do gene alvo na amostra. Por exemplo, se a fórmula da curva padrão for y=3,1372x+38,201 (y é o valor Ct e x é o logaritmo do número de cópias), o número inicial de modelos da amostra pode ser obtido por cálculo inverso.

Correção endogenética (quantificação relativa): Quando é necessário comparar as diferenças de expressão genética entre diferentes amostras, selecione o gene anfitrião (como GAPDH, β-actina) como endogenética, calculando a diferença de Ct entre o gene alvo e o gene endogenética (ΔCt), e analise a expressão relativa usando o método ΔΔCt, eliminando o efeito da diferença de volume da amostra e eficiência da resposta.