As colunas cromatográficas são um componente central do sistema de análise cromatográfica, cuja forma de preenchimento afeta diretamente a eficiência de separação, a simetria de pico e a vida útil das colunas. Um processo de preenchimento razoável deve equilibrar as características do preenchimento, a uniformidade do preenchimento, a estabilidade do leito de coluna e as necessidades de uso posterior. A seguir, o processo de preenchimento e os pontos técnicos da coluna cromatográfica são detalhados em três aspectos do tratamento pré-enchimento, método de enchimento e tratamento pós-enchimento.

Tratamento pré-embalagem

1. Selecção e processamento de embalagens

Tamanho de partícula e distribuição: Selecionar um preenchimento com tamanho de partícula apropriado (geralmente 3-50 μm) de acordo com o padrão cromatográfico (por exemplo, HPLC, GC), e uma distribuição estreita de tamanho de partícula (por exemplo, PDI < 1,2) pode melhorar a uniformidade de preenchimento.

- Tratamento de superfície: preenchimento de matriz de silicone precisa ajustar o pH para evitar a adsorção eletrostática; O preenchimento C18 altamente hidrofóbico requer pré-imersão em metanol ou acetonitril para reduzir a reunião.

- Desespuma e dispersão: a suspensão de preenchimento precisa ser desgasificada por ultra-som para evitar que as bolhas formem buracos durante o processo de preenchimento; A mistura homogênea de alta viscosidade pode ser adicionada com uma quantidade moderada de surfactante, como isopropanol, para melhorar a dispersão.

2. pré-tratamento de coluna cromatográfica

- Limpeza e secagem: os tubos devem ser limpos com solventes como metanol, torfenilo e outros, para remover os resíduos metálicos ou a sujeira do óleo e, em seguida, ser secados com nitrogênio ou vácuo.

- Tratamento da superfície final: a rugosidade da entrada e saída do cilindro deve ser inferior a 0,1 μm para evitar o vazamento de preenchimento; Revestimentos inertes como poliamida podem ser aplicados para melhorar a vedação.

II. Método de preenchimento

Embalagem úmida (Slurry Packing)

Preparação homogênica: misturar o preenchimento com o solvente (como metanol / água, acetonitril / água) para formar uma suspensão com um teor sólido de 5% -30%, oscilação por ultra-som durante 10-30 minutos para garantir a dispersão uniforme.

- Preenchimento da bomba de corrente constante: a bomba de corrente constante de alta pressão injeta homogênea no tubo de coluna, a velocidade de fluxo é geralmente de 5-20 mL / min, a pressão da coluna é controlada em 60-120 bar. Durante o processo de preenchimento, é necessário bater continuamente na parede da coluna para liberar bolhas e promover a acumulação densa do preenchimento.

- Despressão gradiente: diminuir lentamente a velocidade de fluxo para 0,1 mL / min após a conclusão do enchimento, mantendo por 10-15 minutos para estabilizar a estrutura do leito de coluna.

Embalagem de lodo e efluente (Slurry-Effluent Packing)

- Preenchimento de equilíbrio dinâmico: a suspensão de preenchimento e o líquido de substituição (como solvente puro) são bombeados sincronicamente no tubo de coluna para obter a deposição stratificada usando a diferença de densidade. Por exemplo, o preenchimento C18 pode ser substituído por metanol, enquanto o preenchimento de silicone deve corresponder à polaridade do solvente.

- Controle de temperatura: aquecimento a 40-60 ° C pode reduzir a viscosidade do solvente e acelerar a deposição do preenchimento; A coluna é curada após o arrefecimento a temperatura ambiente para evitar que a expansão térmica cause rachaduras.

Embalagem Seca (Dry Packing)

- Cenário de aplicação: usado principalmente em embalagens de grandes partículas (por exemplo, 50-200 μm) ou embalagens de formas especiais (por exemplo, colunas integrais).

- Depósito gravitacional: derrame lentamente o preenchimento no tubo de coluna, bate levemente na parede da coluna e complemente com uma mesa de vibração, para que o preenchimento se acumule naturalmente densamente; A placa porosa é colocada no topo e pressionada para curar até 5-10 Bar.

III. Tratamento pós-enchimento

1. Detecção e correção de colunas

- Inspeção óptica: Observe se a camada da coluna é uniforme por meio de transmissão de luz ou eletroscópio de varredura, se houver rachaduras ou canais, é necessário recarregar.

- Teste de velocidade de fluxo: lavar a coluna com solvente puro, registrar a contrapressão; A pressão ideal da coluna deve estar próxima do valor teórico (por exemplo, a queda da pressão da coluna HPLC ≤ 10% do valor teórico), e o aumento anormal indica defeitos de preenchimento.

2. Avaliação do Pilar

- Verificação padrão: injetar substâncias de pequenas moléculas como naftalênio e benzeno, calcular o número de torres (N > 10.000 / m) e o fator de assimetria (As < 1,5), para garantir que o leito de coluna não tenha fluxo de fossa ou zona morta.

- Teste de estabilidade a longo prazo: amostragem contínua de 100 a 200 vezes para monitorar o tempo de retenção e as mudanças na área de pico, avaliar o grau de fechamento do preenchimento e a capacidade de resistência à poluição.

3. Arquivo e conservação

- Fechamento de ambas as extremidades: selar o tubo de coluna com uma cabeça de bloqueio especial para impedir a entrada de poluentes; Para armazenamento a longo prazo, é necessário conservar com um solvente contendo conservantes (por exemplo, 0,05% de sódio nitrogenado).

- Controle ambiental: a proteção contra a luz é mantida em um ambiente de temperatura constante (15-25 ℃), a coluna de silicone precisa ser estritamente resistente à umidade e a coluna de fase inversa evita o congelamento que leve à destruição da estrutura de preenchimento.

Pontos de preenchimento especiais

1. coluna de cromatografia manual: o preenchimento manual revestido deve ser preenchido em atmosfera inerte para evitar a inativação da oxidação; O preenchimento ligado precisa controlar o pH do preenchimento para evitar a queda do ligante.

Pilhas eletrocromatográficas capilares: preenchimento por polimerização in situ ou eletroforese, que requer controle preciso da força do campo elétrico (por exemplo, 50-200 V / cm) e da composição do tampão.

3. Coluna de cromatografia de pressão ultra alta (UHPLC): Quando se usa um preenchimento sub-2 μm, é necessário equipar um tubo de coluna com resistência a uma pressão superior a 1200 Bar, que é preenchido com a compactação auxiliar de fluidos supercríticos (como CO2).