Antes do uso: pré-tratamento para proteger a coluna cromatográfica da fonte

Ativação e equilíbrio de colunas: colunas novas ou colunas cromatográficas inactivas por mais de 1 semana, com equilíbrio de fase de fluxo por 30-60 minutos (velocidade de fluxo de 1,0 ml / min) antes do uso, para garantir a penetração completa da fase fixa; As colunas de fase inversa, como C18, podem ser lavadas com metanol/água (90:10) antes de mudar para a fase de fluxo da amostra, evitando que a secagem em fase fixa cause redução no desempenho. Se o solvente conservado na coluna é incompatível com a fase de fluxo (por exemplo, a coluna de fase estática é conservada com hexano, a fase de fluxo é metanol), é necessário lavar com um gradiente de solvente de transição para evitar que o solvente se dissolva mutuamente para gerar bolhas ou colapso de fase fixa.

Limpeza da amostra e da fase de fluxo: a amostra deve ser filtrada pela membrana de filtro de 0,22 μm para remover partículas, suspensões e evitar bloquear a tela de coluna; As amostras que contêm impurezas, proteínas e óleos com alto ponto de ebulição devem ser purificadas com antecedência por meio de métodos como extração de fase sólida (SPE) para evitar que as impurezas se adsorem à fase fixa. A fase de fluxo requer desgasificação por ultra-som por 15-20 minutos para remover as bolhas (as bolhas podem causar flutuações na pressão da coluna e anomalias no pico); Quando a fase de fluxo de sal tampão é usada, a água de alta pureza (como água ultrapura) é necessária para ser preparada e usada após a filtração para evitar que o cristal de sal bloqueie a coluna cromatográfica.

Inspeção do estado do instrumento: antes da instalação da coluna cromatográfica, limpe o revestimento da abertura da amostra, substitua a barriera envelhecida para evitar que os detritos da barriera e os resíduos da amostra entrem na coluna; Verifique se a tubulação tem vazamento ou bloqueio para garantir a estabilidade da pressão diante da coluna; Certifique-se de que a junção da coluna está bem selada e escolha uma almofada de grafite correspondente para evitar vazamentos de gás ou pressão desigual que cause danos à coluna.

Em uso: operação padronizada para evitar danos à coluna

Controle de temperatura e pressão: cumprir estritamente a temperatura máxima de uso da coluna cromatográfica (coluna de fase inversa geralmente ≤ 60 ° C, coluna de fase positiva ≤ 80 ° C), para evitar a perda de fase fixa acelerada por alta temperatura; A pressão da coluna deve ser controlada na faixa recomendada da fábrica (geralmente ≤40MPa), se a pressão subitamente aumentar mais de 30%, a detecção de parada imediata (como a fase de fluxo de filtragem, a abertura de entrada de limpeza) é necessária para evitar que a pressão excessiva leve à compactação de fase fixa e colapso do leito da coluna. A taxa de aquecimento é recomendada para ≤10 ℃ / min, para evitar que o aumento da temperatura danifique a estrutura da coluna.

Especificações de uso da fase de fluxo: evitar o uso de solventes fortemente corrosivos (como ácido clorhídrico concentrado, hidroxido de sódio), a faixa de pH da fase de fluxo da coluna inversa deve ser controlada em 2-8 (exceto a coluna especial resistente a ácidos e álcalis), além da faixa levará à dissolução da matriz de silicone e à hidrolise de fase fixa. Quando o gradiente é lavado, a mudança da proporção orgânica não deve ser muito rápida (por exemplo, mudança ≤ 10% por minuto), evitando a contração ou o aumento brusco da fase fixa; Após o uso da fase de fluxo que contém sal tampão, é necessário lavar a fase com alta proporção de água em tempo útil para evitar a cristalização do sal.

Requisitos de operação de amostragem: o volume de amostragem deve corresponder à capacidade da coluna (volume de amostragem da coluna C18 convencional ≤ 20 μL), para evitar sobrecarga que cause atraso em forma de pico e poluição em fase fixa; A temperatura da entrada da amostra é ajustada de forma razoável, acima do ponto máximo de ebulição da amostra de 10-20 ° C, mas não exceda a temperatura máxima de uso da coluna para evitar que a descomposição da amostra produza impurezas na coluna cromatográfica. Evite amostras contínuas de alta concentração e alta poluição, recomenda-se lavar o volume de 10-15 colunas com a fase de fluxo vazio após cada amostra de 10-20 agulhas.

3, após o uso: limpeza oportuna, prolongar a vida útil da coluna

Processo de limpeza regular: após o experimento, enxague a coluna cromatográfica com o gradiente de fase de fluxo para remover amostras residuais e impurezas. Coluna de fase inversa: primeiro lavar o volume de 20 colunas com metanol / água (50:50) e depois lavar o volume de 30 colunas com metanol puro ou nitril acetico para remover as impurezas fortes de adsorção; Colunas de fase positiva: lavar o volume de 20 colunas com hexano/isopropanol (90:10) e conservar com hexano puro. Se a amostra contém proteínas, óleos e outras impurezas difíceis de lavar, pode adicionar 5-10% de tetrahidrofurano (THF) no processo de limpeza para melhorar o efeito de lavagem, mas deve prestar atenção à compatibilidade do THF com a fase fixa parcial.

Tratamento especial da poluição: se a pressão da coluna for elevada e o pico de tração é grave, pode ser a poluição da coluna, pode ser realizada uma limpeza profunda. Coluna de fase inversa: lavar com o gradiente sequencial de metanol → metanol / THF (80: 20) → metanol → acetonitril, com um volume de 20 colunas por etapa; Coluna de fase: lavar com hexano → hexano / acetato de etilo (50:50) → hexano. É proibido lavar a coluna de fase recta com solventes polares fortes (como acetona, diclorometano) para evitar a perda de fase fixa.

Método de conservação: conservação de curto prazo (dentro de 1 mês): coluna de fase inversa é preservada com metanol puro ou nitrilo acetico selado, coluna de fase positiva é preservada com hexano para garantir que não haja bolhas na coluna; Conservação a longo prazo (mais de 1 mês): a coluna de fase inversa é conservada em metanol/água (90:10) e a coluna de fase positiva em hexano/isopropanol (95:5) para evitar envelhecimento seco em fase fixa. É necessário selar ambas as extremidades da coluna cromatográfica com uma cabeça de obstrução e colocar-a em um lugar fresco e seco (temperatura 5-30 ° C) para evitar a luz solar direta.

Com a manutenção das especificações acima, a vida útil da coluna de cromatografia líquida de alta eficiência pode ser prolongada até 1.000-2.000 análises, garantindo a precisão e a repetibilidade dos dados de detecção e reduzindo os custos de uso. Os métodos de manutenção de diferentes tipos de colunas cromatográficas (por exemplo, colunas de troca iónica, colunas manuais) devem combinar ajustes nas instruções do fabricante, com foco na compatibilidade de fase de fluxo e nas propriedades de fase fixa.