[Tratamento de PCR]

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A PCR (reação em cadeia da polimerase) e a eletroferese em gel são técnicas comumente usadas em estudos de biologia molecular, que geralmente são usadas em combinação para identificar e analisar produtos amplificados pela PCR. No entanto, ao realizar eletróforese em gel de PCR, muitas vezes se encontram distúrbios no mapa de eletróforese que podem interferir com os resultados do experimento e até levar ao fracasso do experimento.

Este artigo irá explorar as causas da confusão durante o processo de eletróforese em gel PCR e fornecer algumas soluções possíveis.

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Otimização das condições de PCR:Ajustar as condições de reação de PCR, a temperatura de cozimento muito baixa pode levar à ligação não específica do precursor ao modelo, desencadeando a amplificação não específica; Temperaturas excessivas de cozimento podem inibir a combinação normal do precursor com o modelo, afetando a eficiência da amplificação. A melhor temperatura de anneição pode ser determinada gradualmente por meio de experimentos de PCR gradiente Em geral, a temperatura das etapas de anneição da reação de PCR geralmente está entre 50 ° C e 68 ° C, dependendo da sequência de base do precursor e das propriedades do DNA alvo. Alguns primeiros requerem temperaturas de cozimento mais altas para garantir a combinação específica de uma área específica, mas, em geral, a temperatura máxima de cozimento não excede 68 ° C.

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Desenho não razoável:Se o precursor for muito curto, se a sequência for repetida ou se houver regiões de alto GC, isso pode levar a uma combinação não específica do precursor com o modelo, resultando em confusões. Os primeiros precisam ser redesenhados para garantir que sejam de comprimento adequado, sequências não duplicadas, conteúdo de GC moderado e evitar áreas de alto GC dentro do primeiro ou na área de combinação do primeiro com o modelo.

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Uso inadequado de precursores:O uso excessivo ou pouco específico de precursores pode levar a uma amplificação não específica, resultando em confusões. Recomenda-se trocar os primeiros ou reduzir a quantidade de primeiros.

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O modelo não é puro:O DNA modelo contém impurezas, como proteínas, RNA ou outros fragmentos de DNA não-alvo, que podem servir como modelo para a amplificação da PCR, levando ao surgimento de faixas adicionais.

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Degradação do modelo:O DNA modelo se degrada durante a extração ou armazenamento, e pequenos fragmentos de DNA produzidos podem se tornar modelos para amplificação não específica.

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Purificação do DNA do modelo:O DNA modelo em experimentos de PCR pode vir de várias fontes, incluindo DNA genômico (gDNA), DNA complementar (cDNA) e DNA plasmódico. No entanto, o DNA de diferentes fontes pode variar em composição e complexidade, o que afeta a quantidade inicial ideal de amplificação de PCR. Por exemplo, em uma reação de PCR de 50 µL, apenas 0,1-1 ng de DNA plasmódico é necessário, enquanto que 5-50 ng de gDNA é necessário. Além disso, o tipo de DNA polimerase usado também afeta a quantidade inicial ideal do modelo. A polimerase de DNA modificada é mais afine ao modelo e mais sensível, portanto, a quantidade inicial de DNA necessária é relativamente menor. A otimização da quantidade inicial de DNA é essencial, pois uma quantidade inicial excessiva pode levar a um aumento do risco de amplificação não específica, enquanto uma quantidade inicial excessivamente baixa pode reduzir a taxa de obtenção da PCR. Às vezes, o esquema de PCR usa o número de cópias para indicar a quantidade inicial de DNA, especialmente para o gDNA. O cálculo do número de cópias envolve a constante de Avogadro e a massa molar com a fórmula: número de cópias = L × número molar = L × massa total / massa molar.

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Concentrações elevadas de Mg²:Mg²+ é um componente importante na reação de PCR, mas suas concentrações excessivas reduzem a especificidade da amplificação de PCR e aumentam o risco de amplificação não específica. A melhor concentração de Mg²+ deve ser determinada experimentalmente.

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Uso ou má qualidade das enzimas:O uso excessivo de enzimas ou a má qualidade das enzimas podem afetar a resposta de PCR. Recomenda-se reduzir a quantidade enzimática ou substituir a enzima de outra fonte.

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Usando PCR de inicialização térmica:A PCR de iniciação térmica pode reduzir a amplificação não específica que a reação pode causar a baixas temperaturas.

A PCR de iniciação térmica é uma técnica usada para reduzir a amplificação não específica. Na PCR convencional, o precursor pode ter sido ligado ao DNA modelo antes de a temperatura de reação subir para a temperatura de amplificação. Isso pode levar a amplificação não específica no início da PCR, produzindo resultados confusos ou falsos positivos. A PCR de iniciação térmica resolve esse problema adicionando uma polimerase de DNA térmicamente estável à reação de PCR.

A chave para a PCR de iniciação térmica é o uso de uma polimerase que requer ativação a alta temperatura. Essas enzimas só se tornam ativas a temperaturas mais altas e, portanto, começam a expandir a sequência de DNA alvo no início da reação, sem desencadear uma reação não específica a baixas temperaturas.

Algumas polimerases de iniciação térmica comumente usadas incluem versões melhoradas da polimerase Taq térmicamente estável, como a polimerase Taq DNA com domínio de ativação térmica, e polimerases de alta fidelidade como Pfu ou Phusion.

Portanto, as enzimas atuais cumprem basicamente todas as condições.

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Verifique o ambiente do laboratório:Evite a contaminação do DNA e dos instrumentos experimentais, mantenha o laboratório limpo usando técnicas estériles e reagentes tratados.

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PCR de otimização de gradiente:Usar gradientes de temperatura para a reação de PCR, procurando a temperatura de amplificação específica.

PCR Gradiente 2D InteligenteA deformação e a deformação do gradiente de temperatura da recolha podem ser otimizadas simultaneamente na mesma reação. A deformação do gradiente de temperatura da recolha pode ser definida horizontalmente em 8 linhas. A temperatura da recolha pode ser definida longitudinalmente em 12 colunas, para otimizar a temperatura de recolha ideal e melhorar a especificidade e a eficiência da reação de PCR.

Esta técnica é muito útil para otimizar precursores, modelos e condições de PCR para garantir a obtenção de produtos de PCR de alta qualidade e específicos.

Estes métodos podem ser usados ​​sozinhos ou em combinação para ajudar a reduzir ou eliminar problemas de PCR.