Os medidores de proteínas de ácidos nucleicos são equipamentos-chave em laboratórios de biologia molecular para a quantificação rápida de concentrações de ácidos nucleicos (DNA / RNA) e proteínas. A operação correta não só garante a precisão dos dados, mas também prolonga a vida útil do instrumento. Este artigo apresentará especificações operacionais básicas, perguntas frequentes e dicas práticas para iniciantes em laboratório.
Preparação antes da operação
1. Calibração do instrumento
Calibração em vazio: antes de cada uso, a calibração em vazio deve ser feita com água ultrapura ou tampão, como tampão TE, para eliminar interferências de fundo.
Manutenção regular: se o instrumento não for usado por um longo período de tempo, é necessário recalibrar e verificar se a fonte de luz e o detector estão funcionando normalmente.
2. Preparação da amostra
- Amostras de ácidos nucleicos: Certifique-se de que não há partículas ou impurezas e, se necessário, centrifuge (12.000 rpm, 1-2 minutos) para remover impurezas.
- amostras de proteínas: Evite altas concentrações de desinfetantes (como SDS) para evitar que afetem a detecção de absorção fotográfica.
Escolha o modo de detecção adequado
- Métodos de absorção ultravioleta (como NanoDrop): adequados para medições rápidas de DNA / RNA (260nm) e proteínas (280nm).
Metodologia de fluorescência (como Qubit): adequada para a detecção de ácidos nucleicos de baixa concentração, com maior sensibilidade.
Processo operacional padrão
Inicialização e inicialização
Abra o instrumento e pré-aqueça por 5 a 10 minutos (alguns equipamentos precisam ser pré-aquecidos por mais tempo).
- Escolha o padrão de detecção correspondente (ácido nucleico / proteína).
2. Amostragem e teste
1. plataforma de teste limpa: mergulhe uma pequena quantidade de água ultrapura ou etanol com papel sem poeira para limpar a superfície de teste para evitar a poluição residual.
2. Adicionando:
Instrumento NanoDrop: Coloque a amostra de 1-2µL gota a gota no banco de teste e coloque o braço de teste.
Instrumento tipo vaso biserico: Certifique-se de que o vaso biserico está limpo e adicione a quantidade apropriada de amostras (geralmente 50-200 µL).
Leitura: Clique em "Medir" para gravar os dados.
Limpeza: imediatamente após a conclusão do teste, limpe a mesa de teste com água ultrapura ou etanol para evitar que a cristalização da amostra afete o teste posterior.
Registro e análise de dados
Julgamento da pureza do ácido nucleico:
- DNA: A260/A280≈1,8 (DNA puro), A260/A230 > 2,0 (sem poluentes).
- ARN: A260/A280≈2,0 (ARN puro).
Se a proporção for anormal (por exemplo, A260/A280 < 1,6), pode indicar contaminação por proteínas ou fenóis.
Determinação de proteínas: curvas padrão são necessárias quando o método Bradford ou BCA é usado.
Perguntas e soluções frequentes
Resultados anormais (por exemplo, baixa relação A260/A280)
Possíveis causas: contaminação por proteínas ou solventes orgânicos.
Solução: purifique a amostra novamente ou utilize a quantificação fluorescente (como Qubit).
Erro do instrumento (por exemplo, "Sampletoo concentrated")
Causa possível: A concentração da amostra está fora do limite de teste.
Solução: teste novamente após diluição da amostra.
Deslocação ou instabilidade da linha de base
Possíveis causas: poluição da mesa de teste ou envelhecimento da fonte de luz.
Solução: Limpe a mesa de teste ou entre em contato com um engenheiro para calibrar a fonte de luz.
IV. Habilidades práticas
Evite a interferência de bolhas: durante a amostragem, certifique-se de que as gotas estão intactas e sem bolhas, caso contrário, causará flutuações na absorção.
Teste de amostras de baixa concentração:
- Quantificação com fluorescência (como Qubit), mais sensível do que o método ultravioleta.
Se a técnica ultravioleta for necessária, o volume da amostra pode ser aumentado adequadamente (por exemplo, 2 µL → 3 µL).
Recomendações de armazenamento a longo prazo:
- Ligue pelo menos uma vez por semana para evitar que os componentes ópticos sejam molhados.
Armazenar em ambiente seco e livre de poeira.