O teste de proteínas com analisadores quantitativos de ácidos nucleicos ultra-microscópicos, como o proteômetro de ácidos nucleicos ultra-microscópicos, baseia-se principalmente em espectrofotomia ultravioleta visível, que estima sua concentração medindo a absorção de proteínas em comprimentos de onda específicos, como 280 nm. Aqui estão os métodos específicos e passos-chave para testar a proteína:
I. Princípio do teste
Trp, Tyr e ligações Cys-Cys de dienxofre são absorvidos significativamente em comprimentos de onda de 280 nm. O instrumento calcula diretamente a concentração de proteína (mg/ml) medindo a absorção da solução de proteína a 280 nm (A280), em combinação com a lei de Lambert-Biel. Este método não requer a construção de curvas padrão, mas garante que a amostra não contenha outras impurezas com forte absorção a 280 nm (por exemplo, ácidos nucleicos, fenóis).
II. Passos operacionais
Preparação do instrumento
Conecte a fonte de alimentação, inicie o instrumento e preaqueça por 5-10 minutos para o estado estável.
Selecione o modo de detecção "Proteina A280" e defina a distância óptica (geralmente 10 mm, mas o instrumento pode ajustar-se automaticamente).
Calibração de ponto zero com água destilada de alta pureza ou tampão vazio para eliminar interferências de fundo.
Tratamento de amostras
Volume de amostra: recomenda-se a utilização de amostras de 2 μL (alguns instrumentos suportam detecção de traces de 0,5-2 μL) para garantir a formação de uma coluna de líquido estável.
Evite bolhas: toque no fundo do orifício de detecção durante a amostragem, liberando lentamente o líquido para evitar que as bolhas afetem a medição da absorção de luz.
Tensão superficial: se a tensão superficial da amostra for baixa (por exemplo, contendo descontaminante), o volume da amostra pode ser aumentado para 4 μL para garantir a estabilidade da coluna de líquido.
Comparação em branco
Tome 2 μL de solução em branco (como tampão) e adicione-a à base inferior, coloque a base superior e clique no botão "em branco" para registrar a absorção de fundo.
Limpe a base para garantir que não haja líquidos residuais.
Teste de amostra
Pegue a amostra de 2 μL para medir e adicione à base inferior, coloque a base superior e clique no botão "Amostra".
O instrumento mede automaticamente a absorção e calcula a concentração, e os resultados são geralmente apresentados em mg/ml.
Amostras de alta concentração: se o valor de absorção exceder o alcance do instrumento (por exemplo, intensidade de luz < 200), a amostra deve ser diluída e re-testada.
Registro e limpeza de dados
Salve os resultados do teste e exporte-os em formato CSV ou PDF.
Limpe a base com um pano sem poeira para evitar a poluição cruzada.
III. Observações essenciais
Calibração de linha de base
O comprimento de onda padrão de calibração de linha de base é de 340 nm, que o usuário pode ajustar conforme necessário.
A calibração deve ser concluída antes da detecção da amostra, caso contrário os valores espectrais serão desviados, resultando em erros de cálculo da concentração.
Pureza da amostra
Evite amostras que contenham ácidos nucleicos, fenóis ou íons salinos em altas concentrações, que podem interferir com a absorção a 280 nm.
Para a detecção de amostras contendo impurezas, pode-se combinar a cromatização (por exemplo, BCA, Bradford) ou usar comprimentos de onda duplos (280 nm/340 nm) para deduzir o fundo.
Manutenção de instrumentos
Fonte de luz: Evite a exposição prolongada e desligue a fonte de luz quando não estiver em uso para prolongar a vida útil.
Monocromático: substitua regularmente o secador (como o gel de silicone) para evitar que os elementos dispersos sejam molhados.
Detector: impede a luz intensa direta ou a acumulação de poeira humida para manter-se limpo.
Ambiente: o instrumento deve ser colocado em uma mesa seca e estável, longe da saída do ar condicionado ou da luz solar direta, e a temperatura deve ser controlada em 25 ℃ ± 2 ℃.
Tratamento de amostras especiais
Amostras condensadas: carrega lentamente com uma parede inclinada de 45 graus para evitar derramamentos ou interferências do anel de Newton.
Substâncias poliaçúcares: após a detecção, é necessário lavar a via líquida com um reagente de etanol para evitar resíduos.
Amostras de óleo: se ocorrer o fenômeno superior, a separação centrífuga a baixa temperatura é necessária antes de ser detectada.
Cenários de aplicação e vantagens
Quantificação rápida: sem pré-tratamento complicado, a detecção é concluída em 2-5 minutos, adequado para triagem de alto fluxo.
Microdetecção: somente amostras de 0,5-2 μL são necessárias para economizar amostras valiosas (por exemplo, amostras clínicas, proteínas raras).
Análise multiparâmetro: Alguns instrumentos suportam a detecção simultânea de A260 (ácido nucleico), A280 (proteína) e OD600 (concentração de bactérias) para a quantificação multicomponente.
Portabilidade: design compacto para inspeções de campo ou laboratórios móveis.