A coluna cromatográfica é um componente central da análise cromatográfica, cujo desempenho afeta diretamente o efeito de separação e a precisão dos resultados de teste. Uma conservação razoável pode prolongar a vida útil da coluna cromatográfica e evitar a queda ou danos no desempenho devido à operação inadequada. Aqui está um guia detalhado sobre a conservação da coluna cromatográfica, que abrange vários aspectos, como instalação, uso, armazenamento e manutenção.

Preparação antes da instalação

1. Inspeção de aparência

- A nova coluna cromatográfica deve ser verificada antes de ser usada para que a coluna esteja intacta, sem rachaduras, arranhões ou vazamentos.

- Certifique-se de que a junção da coluna coincide com o instrumento para evitar que a incompatibilidade da rosca cause vazamentos ou danos.

2. Teste de compatibilidade de fluxo

- Enxague a coluna cromatográfica com um solvente de baixa viscosidade (como metanol ou acetonitril) antes da utilização para eliminar as impurezas restantes durante o processo de produção.

Teste a compatibilidade da fase de fluxo com a coluna cromatográfica, evitando o uso de solventes fortes ácidos, alcalinos ou corrosivos (como TFA).

Adaptabilidade do sistema

- Certifique-se de que a resistência à pressão da coluna cromatográfica coincida com a pressão do sistema do instrumento, evitando que a operação de sobrepressão cause o colapso da coluna.

- Registrar o modelo e as especificações da coluna cromatográfica (por exemplo, tamanho de partícula, diâmetro de abertura, cobertura C18, etc.), de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante.

Manutenção no uso diário

1. Seleção e gestão da fase de fluxo

- Controle de pH: colunas de cromatografia de fase inversa (como colunas C18) aplicam uma faixa de pH de 2-8, excedendo essa faixa pode danificar a matriz de silicone.

Proporção de solventes orgânicos: Evitar mudanças dramáticas na proporção de solventes orgânicos na fase de fluxo (por exemplo, mudar diretamente de 100% de água para 100% de solvente orgânico), a transição de gradiente é necessária para evitar a contração ou expansão do leito de coluna.

- Filtração e desgasificação: a fase de fluxo é filtrada através de uma membrana de filtro de 0,22 μm e desgasificada por ultra-som para evitar a detecção de interferência de partículas pequenas bloqueando o leito de coluna ou bolhas.

2. Tratamento pré-amostra

As amostras devem ser centrifugadas ou filtradas (membrana de filtro de 0,22 μm) para remover partículas em suspensão ou precipitação.

- Evitar a introdução direta de amostras de alta concentração e diluir até a capacidade da coluna (referência aos parâmetros de carga fornecidos pelo fabricante).

As amostras complexas recomendam a utilização de colunas de proteção para interceptar impurezas e prolongar a vida da coluna principal.

3. Controle de velocidade e pressão

- De acordo estritamente com a velocidade de fluxo recomendada pela coluna cromatográfica, a velocidade de fluxo excessiva levará a uma pressão excessiva da coluna e acelerará o desgaste do preenchimento.

- A velocidade de fluxo de coluna antifásica convencional é de 0,5-2 mL/min, e a velocidade de fluxo de coluna de cromatografia líquida de alta eficiência (UHPLC) pode ser baixa até 0,1-0,5 mL/min.

- Quando a pressão do sistema aumenta repentinamente, verifique imediatamente as causas de parada (como bloqueio da cabeça do cilindro ou poluição da tela).

4. Lavagem e limpeza

- Após cada uso, enxague a coluna cromatográfica com água pura ou solvente de baixa viscosidade (como metanol) por 10-20 minutos para remover as amostras residuais ou os sais.

- Após uso prolongado, as operações de regeneração da coluna (como refluxo, limpeza a alta temperatura ou regeneração química) podem ser realizadas para restaurar o efeito da coluna.

Armazenamento e conservação

Armazenamento a curto prazo (dias a semanas)

- Coluna de cromatografia de fase inversa: conservar com metanol-água (1: 1) ou metanol puro para evitar secagem que cause rachaduras no preenchimento.

- Coluna de cromatografia em fase positiva: conservar com hexano ou cloroformo para evitar falhas na absorção de água.

- A temperatura de armazenamento é a temperatura ambiente, evitando ambientes congelados ou de alta temperatura.

Armazenamento a longo prazo (mais de um mês)

- Remova a coluna cromatográfica do instrumento e veda as duas extremidades contra contaminação.

- Armazenar em um lugar fresco e seco, verificar regularmente a vedação para evitar que a volatilidade do solvente leve à fissura seca do leito de coluna.

Recuperação e reparação de colunas

1. Operação de recuperação

- Aplicável a situações em que o efeito da coluna caiu, mas não falhou completamente, reorganizar o preenchimento por lavagem inversa para restaurar a uniformidade do leito da coluna.

A velocidade de refluxo deve ser inferior à velocidade de fluxo positiva (por exemplo, 0,2 mL / min), o tempo é controlado em 10-30 minutos.

2. Regeneração química

- Coluna de matriz de silicone: pode ser mergulhada em solução de metanol a 10% e limpa por ultra-som para remover impurezas hidrofóbicas.

- Colunas de polímeros: resistentes, podem ser lavadas e regeneradas com solventes orgânicos de alta concentração (como nitrilo de acetato puro).

3. Regeneração a alta temperatura

- Aplicável para colunas cromatográficas resistentes a altas temperaturas (como colunas C18), elevar a temperatura da coluna para 50-60 ° C, lavar com metanol e dissolver as impurezas solúveis em gordura adsorbidas ao enchimento.

Perguntas e respostas frequentes

1. Aumento da pressão da coluna

- Causa: bloqueio da cabeça do cilindro, poluição da tela ou colapso do preenchimento.

- Solução: enxague a cabeça do cilindro, substitua a placa de filtragem ou a coluna de cromatografia regenerada.

2. Pico alargado ou arrastado

Causa: envelhecimento do preenchimento, resíduos de locais ativos ou pH de fase de fluxo inadequado.

- Solução: ajustar o pH da fase de fluxo, regenerar a coluna cromatográfica ou substituir uma nova coluna.

3. Deslocamento de tempo de retenção

- Causa: alteração da composição da fase de fluxo, flutuação da temperatura da coluna ou falha parcial do enchimento.

- Solução: Verifique a proporção de fluxo, estabilize a temperatura da coluna e regenere ou substitua a coluna cromatográfica, se necessário.

VI. Atenção

1. Evite a entrada de bolhas: as bolhas danificam a estrutura do leito de coluna, levando ao aumento do espaço de preenchimento e afetando o efeito de separação.

Desativar solventes incompatíveis: como o tetrahidrofurano (THF) pode dissolver a matriz de silicone, com cuidado ao usar.

Registro de uso: rastreie o número de vezes que as colunas cromatográficas são usadas, o tipo de amostra e as operações de manutenção para facilitar a previsão da vida útil.