O sistema de imagem em gel, combinado com imagem óptica e análise de software, permite a quantificação precisa do peso molecular e a análise de concentração. Seus principais processos e pontos técnicos são os seguintes:

Princípios e passos de quantificação precisa do peso molecular

Construção de curvas padrão

O sistema utiliza faixas DNAMarker de peso molecular conhecido como referência, marcando sua localização através do software e gerando curvas de ajuste para a distância de migração de peso molecular. Essa curva baseia-se na relação linear entre o peso molecular e a taxa de migração na eletrofese, garantindo a precisão do cálculo do peso molecular da faixa desconhecida. Por exemplo, depois que o peso molecular das faixas marcadoras em um filme de DNA (por exemplo, 100bp, 500bp, 1000bp) é marcado, o sistema ajusta automaticamente a curva para cálculos posteriores do peso molecular das faixas desconhecidas.

Cálculo de peso molecular de faixa desconhecida

Depois de colocar o gel após eletroferese da amostra a ser testada em um sistema de imagem, estimulando a fluorescência (por exemplo, coloração EB) por meio de fontes de luz ultravioleta ou visível, o software captura a imagem e calcula seu peso molecular em combinação com a curva padrão com base na posição de migração da faixa desconhecida no gel. Este método é mais preciso do que as estimativas de olho nu e o erro pode ser controlado dentro de ± 5%.

Método de quantificação precisa de concentração

Calibração e comparação de densidade

O sistema primeiro calibra a faixa padrão de concentração conhecida (por exemplo, o conteúdo de DNA de uma faixa em um filme de DNA) e, em seguida, usa o software para clicar na faixa desconhecida e comparar a diferença de densidade com a faixa padrão para calcular a concentração desconhecida da amostra. Por exemplo, se a densidade padrão da faixa é de 100 unidades e a concentração correspondente é de 50 ng/μL e a densidade desconhecida da faixa é de 50 unidades, a concentração é de aproximadamente 25 ng/μL.

Relação linear de densidade óptica

A absorção de luz da amostra é linear com a concentração ou a massa. O sistema calcula a concentração desconhecida da amostra medindo a densidade óptica da faixa (escala de cinza ou intensidade de fluorescência) em combinação com curvas padrão ou dados de amostra conhecidos. Este método é aplicável para a determinação de concentrações de DNA, RNA e géis proteicos, como o gel PAGE.

Garantia técnica essencial

Otimização do sistema óptico

A utilização de fontes de luz ultravioleta ou de luz branca para garantir a distribuição uniforme da luz e reduzir o efeito da desigualdade da densidade óptica sobre os resultados. As câmeras CCD ou digitais de alta resolução capturam imagens que, em combinação com o design da caixa escura, protegem a interferência da fonte de luz externa para melhorar a qualidade da imagem.

Funções de análise de software

O software suporta dedução de fundo, separação de faixas, varredura de densidade e outras operações para gerar e integrar curvas de varredura longitudinal para alcançar quantificação precisa. Por exemplo, na quantificação por PCR, o software pode calcular a percentagem relativa de faixas em faixas totais e a varredura de densidade gera uma curva de distribuição longitudinal dos valores da escala de cinza da faixa.

Cenários de aplicação e vantagens

Pesquisa de Biologia Molecular: Determinação precisa do peso molecular e concentração de DNA/RNA para auxiliar a clonagem de genes e validação de sequência.

Engenharia de proteínas: Análise quantitativa da proporção de produtos de expressão de proteínas para otimizar o processo de fermentação.

Desenvolvimento de medicamentos: avaliar a pureza dos medicamentos através de medições de concentração para garantir o controle de qualidade.

O sistema permite a quantificação dupla e precisa do peso molecular e da concentração através de processos padronizados e tecnologias avançadas, fornecendo um suporte confiável de dados para pesquisas em ciências da vida.