A coluna de troca catiônica híbrida combina o modo de retenção dupla de troca catiônica e cromatografia de fase inversa, o seu método de operação precisa equilibrar as características dos dois mecanismos, as etapas específicas e os pontos-chave são os seguintes:
Preparação antes da operação
Selecção de colunas
Escolha a coluna misturada adequada de acordo com as propriedades do composto alvo (por exemplo, valor de pKa, polaridade). Por exemplo, a coluna do grupo sulfato ácido forte é aplicável a compostos alcalinos de pKa2-10 (por exemplo, aminas, drogas sulfamínicas).
Confirmar a estabilidade da matriz pilar (por exemplo, co-polímero de estireno-diinilbenzeno) e dos grupos funcionais (por exemplo, grupos de sulfato) para garantir que não se decomponha na faixa de pH 0-14 e em solventes orgânicos.
Inspeção do equipamento
Verifique se a velocidade de fluxo e a faixa de pressão do sistema cromatográfico (por exemplo, HPLC) correspondem aos requisitos da coluna (por exemplo, pressão máxima de 4500 psi para a coluna de aço inoxidável e 3000 psi para a coluna de vidro).
Instale uma coluna de proteção para evitar que a coluna de análise seja contaminada ou bloqueada.
Preparação do Reagente
Prepare a desinfecção (por exemplo, solução de metanol ácido, tampão de ácido cítrico) e desgase, filtre (membrana de filtro de 0,2-0,5 μm) para evitar interferências de bolhas e partículas.
Prepare o solvente ativado (por exemplo, metanol, água) e a solução de lavagem (por exemplo, uma mistura de solventes orgânicos e sal tampão).
II. Passos operacionais
Ativação da coluna
Objetivo: remover as impurezas para que a fase fixa se inche completamente e assegure o efeito da coluna.
Método:
Ativar a coluna com metanol (3-5 vezes o volume do leito de coluna, velocidade de fluxo 1-5mL / min) e água (o mesmo volume e velocidade de fluxo).
Se a coluna não for usada por muito tempo, deve ser lavada com uma grande quantidade de água, depois com metanol e, finalmente, conservada em uma solução aquosa contendo metanol a 50%.
Como na amostra
Objetivo: combinar o objeto alvo com a fixação, e as impurezas fluem para fora com o fluxo.
Método:
Coloque a solução da amostra lentamente através da coluna a uma velocidade de fluxo de 0,5-2mL / min para garantir um contacto uniforme com a fase fixa.
Se a concentração da amostra for elevada demais, deve ser diluída para evitar exceder a capacidade de carga da coluna.
Limpeza
Objetivo: remover as impurezas que são diferentes das propriedades do objeto alvo, mas que são absorvidas na coluna.
Método:
Escolha uma solução de limpeza que contenha solventes orgânicos e sal tampão (por exemplo, solução de metanol a 5%) em uma dose de 3-5 vezes o volume do leito de coluna com uma velocidade de fluxo de 1-3 mL / min.
Para evitar que o alvo seja removido, é necessário otimizar o tipo e a proporção do limonador.
Limpeza do alvo
Objetivo: destruir a interação entre o alvo e a fase fixa, coletar a depuração.
Método:
Escolha uma mistura de alta concentração de ácido / álcali e solvente orgânico (como solução de metanol ácido) como líquido de lavagem, a dose é de 2-4 vezes o volume do leito de coluna, a velocidade de fluxo de 1-3mL / min.
Recolha a depuração para evitar que a depuração excessiva leve à perda do alvo.
Recuperação e conservação dos pilares
Objetivo: restaurar o estado inicial da coluna e prolongar a vida útil.
Método:
Enxague primeiro a coluna com uma grande quantidade de água, depois com metanol e, finalmente, mantenha-a em uma solução aquosa contendo metanol a 50%, selada e colocada à temperatura adequada.
Se a coluna estiver contaminada, pode ser lavada com soluções especiais como 1MNH4 NO3 ou isopropanol.
III. Observações essenciais
Controle de velocidade
Evite que a velocidade de fluxo excessiva cause redução do efeito de coluna ou perda de fase fixa, e que a velocidade de fluxo excessivamente lenta prolonge o tempo de análise.
A velocidade de fluxo deve ser ajustada gradualmente para evitar perturbações na cama de enchimento.
Limitação de pH e temperatura
Evite o uso de pH extremo, como um solvente alcalino com pH > 6,5 ou um solvente ácido com pH < 2,5, para danificar a coluna da matriz de silicone.
Recomenda-se o uso da coluna a temperatura ambiente abaixo de 40 ° C, altas temperaturas podem diminuir a estabilidade.
Escolha de Desidratação
Evite o uso de tampões que contenham produtos de decomposição, como ácido salicílico, para evitar alterar as propriedades de fase fixa.
O líquido de lavagem deve ser formulado fresco para evitar que a contaminação microbiana ou mudanças na intensidade iónica afetem o efeito de separação.
pré-tratamento da amostra
Filtre as amostras para remover as impurezas das partículas e evitar a obstrução da coluna.
Se as amostras diferem muito da polaridade da fase de fluxo, é necessário derivar ou diluir.
Exemplos de cenários de aplicação
Inspeção de segurança alimentar: ao detectar melamina (composto alcalino) no leite, a separação eficiente é alcançada através de um duplo modo de troca de catiões fracos e retenção de fase inversa usando uma coluna de fase inversa de troca de catiões fracos.
Análise de drogas: Ao analisar drogas alcalinas no sangue e seus metabólitos, o mecanismo de retenção dupla de coluna inversa de troca de catiões fortes híbridos é usado para melhorar a eficiência e a sensibilidade da separação.
Monitoramento ambiental: detecção de poluentes alcalinos (como compostos aminicos) em corpos de água, obtendo uma rápida lavagem e análise quantitativa do alvo através da otimização das condições de lavagem.