Introdução
A bioimpressão 3D é definida como um modelo funcional de estrutura 3D ou tecido artificial de células e materiais biocompatíveis. Esta tecnologia transformou o campo da engenharia de tecidos, tornando possível a criação de estruturas com projetos pré-definidos complexos, garantindo ao mesmo tempo a repetibilidade. Vários métodos baseados em bioimpressão 3D foram relatados para engenharia de vários tecidos, como cartilagem, osso, osso e regeneração da pele. Esta técnica também foi usada para criar novos modelos de tumores pré-clínicos. De fato, como os modelos de cultura celular 2D são cada vez mais questionados devido à falta de previsibilidade, a bioimpressão 3D tornou-se uma abordagem alternativa para evitar esse problema através do processamento de diferentes moléculas derivadas da matriz celular e extracelular, a Modelagem / Demonstração do Microambiente do Tumor (TME). Muitos modelos tumorais baseados em bioimpressão 3D incluem câncer de pulmão, câncer de mama 5 e glioblastoma 6. 7 Estes modelos mostram vantagens no design, com flexibilidade e repetibilidade em comparação com outras estratégias como bolas celulares e organoides. O câncer de ovário é um grande problema de saúde pública e a bioimpressão 3D ainda está sendo estudada como um modelo de câncer de ovário. Nestes tipos de tumor, foi demonstrado que os fibrócitos associados ao câncer (CAF) interagem estreitamente com as células cancerosas e desempenham um papel importante na invasão do câncer e na resistência aos medicamentos. 8, 9 Portanto, CAFs são a chave para projetar modelos de câncer de ovário.
Vantagens
Triagem de alta connotação e transfeção instantânea ajudam a caracterizar e validar experimentos de bioimpressão 3D • Expressão genética instantânea é uma ferramenta poderosa para aumentar a versatilidade de modelos de bioimpressão 3D • Ferramentas de análise de comprimentos de onda múltiplos são necessárias para explorar as interações de diferentes grupos de tipos celulares dentro do modelo, aproveitando ao máximo o poder dos modelos de bioimpressão 3D Nesta nota de aplicação, a bioimpressão 3D é usada para criar modelos de câncer de ovário que contêm células cancerosas (células SKOV3) e fibroblastos CAF (células MeWo). Transfectar as células SKOV3 com o plasmídio GFP jetOPTIMUS (Polyplus) e tingir as células MeWo com CellTracker e Orange CMRA Dye (ThermoFisher). Ambos os tipos de células são contidos na gelatina - alginato - à base de hidrogel para obter estruturas tumorais cilindricas usadas ​​para formar. A homogeneidade do modelo e a repetibilidade da distribuição celular dentro desses tumores foram avaliados com o ImageXpress Pico.
Resultados e discussões
Como mostrado na Figura 1, a imagem estrutural de bioimpressão mostra que as células SKOV3 que expressam GFP e as células MeWo com coloração fluorescente são homogeneizadas na matriz gelatina-alginato (Figuras 1A e B). Isso é muito importante porque a distribuição homogênea de células distribuídas uniformemente na tinta biológica é um fator importante a considerar durante o processo de impressão 3D 12 Além disso, TME natural é conhecido por conter vários tipos de células que interagem estreitamente. Portanto, é essencial reproduzir isso ao construir modelos tumorais in vitro para promover a interação entre o câncer e as células matrizes.
Enquanto os tumores devem combinar vários tipos de células para simular melhor a heterogeneidade da TME, o número e a proporção de cada tipo de célula precisam ser controlados para garantir a repetibilidade. O ImageXpress Pico é especialmente adequado para realizar esse tipo de controle, uma vez que permite capturar várias imagens de microscópio de forma rápida e fácil. O software CellReporterXpress permite a quantificação de múltiplas células, mesmo em amostras grossas, com a projeção máxima do Z-stack. Nesta nota de aplicação, este sistema usado para analisar nosso modelo de tumor bioimpresso mostrou boa repetibilidade em termos de número e proporção de células em 6 estruturas bioimpressas, com o número médio de células SKOV3 (contagem de células FITC) de 837 ± 200 (desvio padrão ≤ 25%). Para as células MeWo (contagem de células TRITC), o número médio foi de 3.264,50 ± 462 (StD ≤ 15%).

Figura 1 Análise de tintura CMRA estrutural bioimpressa 3D de células SKOV3 contendo plasmídeos GFP transfectados e células MeWO tingidas com CellTracker Orange. A) Imagens FITC e TRITC de estruturas bioimpressas 3D no buraco B3 coletadas com o sistema ImageXpress Pico (4X, Z-stack). B) Análise de máscaras de contagem de células FITC e TRITC criadas usando o software CellReporterXpress. C) Número médio de células nos canais FITC e TRITC da amostra (5 buracos, manchado e transfectado) e controle negativo (3 buracos, não manchado e não transfectado). D) Avaliação da eficiência da transfeção, usando plasmidos GFP e kits jetOPTIMUS-Polyplus-transfection-transfection (porcentagem de células positivas FITC / células positivas TRITC).

Materiais e métodos
Preparação de hidrogel
Para a preparação de hidrogel, a qualidade necessária para a gelatina e algato de sódio em pó é pesada, sob raios ultravioletas durante 1 hora e, em seguida, dissolvido em Dulbecco melhorado EagleMedium misturado com o médio de cultivo essencial lowest (MEM), suplementado com soro fetal bovino de 10%. A solução resultante é mantida durante a noite sob agitação magnética a 37 ° C para homogeneização completa. Transfeção e coloração celular Transfeção de células SKOV3 com plasmídio jetOPTIMUS (Polyplus) GFP de acordo com as instruções do fabricante. Em suma, dilua a quantidade adequada de DNA no tampão jetOPTIMUS e adicione o reagente de transfeção jetOPTIMUS adequadamente. A solução de transfeção é mantida a temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, é adicionada às células SKOV3 cultivadas em um frasco T75 com uma fusão de 60-80%. Tinha as células MeWO com o corante CMRA CellTracker Orange (ThermoFisher), de acordo com as instruções do fabricante. 11 Em suma, o corante é dissolvido em DMSO para preparar uma solução de trabalho e, em seguida, diluído em meio MEM. Incubar as células a 37 ° C por 30 minutos. Em seguida, retire a solução de reagente e substitua-a por fresca.completomeios de cultivo.

Figura 2 Esquema de métodos para bioimpressão e imagem da estrutura do modelo de câncer de ovário.