Introdução
A sequência de ARN unicelular (scRNA-seq) é uma técnica usada para caracterizar sem viés a expressão de genes em amostras de células e tecidos complexos. Embora o scRNA-seq chedi tenha mudado a biologia moderna, ele ainda é tecnicamente desafiador e geralmente caro. A solução atualmente no mercado é capaz de analisar eficazmente uma pequena quantidade de células em um pool inicial de dezenas de milhares de células. No entanto, um esquema simplificado de preparação da biblioteca de scRNA-seq para o tratamento de populações de células raras ainda está ausente. Aqui, desenvolvemos um novo método de detecção de placas perfuradas para seqüências de scRNA altamente sensíveis e econômicas. O fluxo de trabalho suporta a preparação de bibliotecas de amostras raras de populações de células raras. Neste novo fluxo de trabalho (Figura 1), usamos DispenCell e aspiradores de teste dedicados (SEED Biosciences, Suíça), com um sistema de preparação de biblioteca de células únicas dedicado e otimizado (MERCURIUS Kit de alta sensibilidade BRB-seq, que é usado para o teste de alta sensibilidade BRB-seq). Alithea Genomics， Suíça).
Distribuição de células únicas
Primeiro, antes da preparação da biblioteca de sequenciamento, testamos a capacidade do DispenCell de distribuir células individuais em tampões de fissão dedicados. Linhas de linfocitos são descongelados a partir de frascos congelados, transmitidos duas vezes e, em seguida, colhidos em suspensão unicelular. Filtre as células com um filtro celular de 10 μm (Miltenyi Biotec, Alemanha), conte e dilua em uma solução de distribuição de metilcelulose sem RNAse (DispenMe, SEED Biosciences) até a concentração final de 2 x 104 células/mL. Em seguida, carregue 200 células da suspensão celular usando a cabeça de sensor DispenCell. Configurar DispenCell para distribuir uma única célula para uma placa de 384 orifícios com uma placa de orifícios pré-instalada com 4,2 μL de tampão de cracking (HS BRB seq Kit, Alithea Genomics). Os primeiros 96 buracos são alocados por cerca de 7 minutos. Em seguida, pare a distribuição porque temos amostras suficientes para análise a jusante.
Controle de Qualidade Unicelular
Imediatamente após a distribuição, usamos o software DispenSoft desenvolvido pela SEED Biosciences para o pós-tratamento de controle de qualidade de uma única célula. Cada buraco na placa de buraco é representado por uma matriz codificada por cores (Figura 2.a). Quando o buraco contém uma única célula, o software o marca como verde, enquanto o buraco vermelho contém zero ou mais células e deve ser descartado. Para distinguir entre fragmentos e células, um limiar é definido através do controle de porta de um histograma baseado no tamanho (Figura 2.b). Somente picos acima do limiar são considerados células.
Aqui, obtivemos 77 buracos unicelulares (taxa de separação unicelular de 80%). Com o DispenSoft, os dados de impedância brutos também podem ser usados para gravar o processo. Cada curva de impedância pode ser verificada manualmente. Um pico único é característico de uma única célula (Figura 2.c), enquanto várias células produzem vários picos. Isso sugere que DispenCell é capaz de distribuir células em tampões de fissão em um processo simples, rápido e wanquantraceável.