Embora a estratégia de triagem anterior dos autores para identificar variantes genéticas humanas alternativas de genes de levedura tenha sido bem sucedida, a estratégia foi complicada e identificou apenas dois inibidores (Kachroo et al., 2015). A técnica requer a separação artificial das colônias e, em seguida, realizarQuartoIsolar e identificar inibidores requer triagem artificial de centenas de colônias de leveduras. Assim, os autores desenvolveram um novo processo para triar os subplasmídeos inibidores de forma automática de alto fluxo (Figura 1a).

Os autores se concentraram especialmente na triagem de mutações inibidoras na proteína humana não complementar β2c (HsPSMB7), uma subunidade proteasômica com expressão formativa. Este método permite uma triagem em grande escala e sem erros em um tempo significativamente menor. O experimento foi realizado sob a forma de placas de 96 buracos e através de uma matriz genética sintética (SGAou a seleção MM para separar mutantes específicos do monocloro, sem a necessidade de separação do quartilo (Pan et al., 2004; Kuzmin et al., 2016). Mediante a determinação da dependência plasmídica usando 5-FOA selecionado, a complementaridade foi confirmada como associada a variações em genes humanos baseados em plasmídeos URA3. Usando essa estratégia, os autores conseguiram obter várias mutações de inibição substituíveis no gene HsPSMB7. Ao longo do artigo, os autores sempre usaram os termos "substituição funcional", "substituibilidade" ou "capacidade de substituição" para se referir à capacidade de genes humanos ou suas variantes compensarem a função de seus genes homógenos de levedura. O processo de triagem foi desenvolvido com base em várias considerações. O tipo selvagem humano PSMB7 (β2c) não é capaz de substituir o gene homogênico da levedura β2 ScPUP1, como demonstrado pelos fenótipos letais observados na eliminação seletiva do gene da levedura (Figura 1b, Suplemento Figura 1b) (Kahro et al., 2015). Em contraste, se o gene humano (ou suas variantes) substituir com sucesso a função do gene hospedeiro, a cepa será capaz de crescer, servindo assim como um simples indicador de detecção para a substituição funcional. As estratégias de PCR com taxas de erro mais elevadas geraram um banco de genes de mutações HsPSMB7 em um veículo de expressão de levedura marcado com URA3, com uma média de 1 a 4 mutações por gene (Figura 1a).

Para determinar se qualquer alelo mutante do PSMB7 poderia compensar a mortalidade causada pela remoção de genes homônimos de levedura, os autores transformaram o banco de genes de mutações para a cepa HetKO PUP1/pup1Δ::kanMX da dupla levedura (Pan et al., 2004). O esquema de conversão foi expandido para obter milhares de colônias de levedura separadas umas das outras, cada uma carregando diferentes plasmídeos mutantes do gene PSMB7 (Figura 1b). Milhares de colônias foram selecionadas de forma automatizada com o QPix 460 e vacinadas em um meio pré-esporizado de GNA em um formato de 96 poços.O G418A seleção filtra pup1Δ com a marca kanMX. Após a formação dos esporos, esporos de levedura monoeplémica pup1Δ::kanMX sobrevivêveis que carregam diferentes alelos humanos de PSMB7 foram selecionados em meio MM (sem Leu, Arg, His, Ura e CAN) (na presença de G418) (Figura 1c, painel inferior). Como um controle interno para a eficiência de formação de esporos, os autores também testaram o crescimento de esporos monoclopédicos de tipo selvagem PUP1 no meio de cultura MM (sem G418) (Figura 1c, painel superior). Os resultados da triagem mostraram que 19 colônias cultivadas em meio MM + G418 (imagem representativa na Figura 1d) podem carregar variantes humanas complementares de PSMB7. Estes mutantes de inibição monoeplémica são então testados para determinar se a inibição é causada por um gene mutante humano que carrega os plasmídeos. A dependência plasmódica das células de levedura foi testada com base na falta de crescimento do 5-FOA, que inibe o gene URA3. Sete desses 19 mutantes inibidores não sobreviveram em meios de cultura de 5-FOA, sugerindo que as variantes do gene humano nestas cepas são necessárias para sua sobrevivência (Figura 1d).

Idealmente, humanizar leveduras para caracterizar funcionalmente os genes humanos usaria alelos humanos de tipo selvagem em leveduras. No entanto, a triagem de inibidores e os dados de intercâmbio de cauda terminal c sugerem que o β2c humano precisa mutar para interagir com subunidades de levedura vizinhas, especialmente Scβ3, para ser montado corretamente em CP de levedura. Assim, as estratégias para restaurar essas interações subunidades específicas humanas podem permitir a integração do tipo selvagem HsPSMB7 no proteasoma da levedura. Para validar essa hipótese, os autores perguntaram se o β2c humano de tipo selvagem poderia substituir funcionalmente seus contrapartes de levedura nas cepas. Os autores desenvolveram uma abordagem baseada em CRISPR-Cas9 para visar os genes ScPUP1 (β2) e ScPUP3 (β3) da levedura. A levedura de conversão plasmídica que expressa Cas9-sgRNAScPUP1 ou Cas9-sgRNAScPUP3 pode causar sua morte. Se os genes humanos pudessem substituir funcionalmente a leveduraGenes homogênicosEm seguida, um modelo de reparação genética humana que contém as sequências homólogas terminais correspondentes aos locais de levedura 5' e 3' será co-transformado e é esperado que as células sobrevivam.

Os autores testaram primeiro se o tipo selvagem HsPSMB7 poderia substituir ScPUP1 no local in situ, mas não conseguiu obter nenhuma colônia sobrevivente, como esperado (Figura 2a). No entanto, usando variantes HsPSMB7 com mutações T44A ou S214G, o modelo de reparação permite a substituição funcional do gene PUP1 da levedura (Figura 2b). Anteriormente, os autores demonstraram que, quando o gene β3 (PUP3) da levedura é expresso nos plasmídeos, ele pode ser substituído funcionalmente por seu homólogo humano (HsPSMB3) (Kachroo et al., 2015). Usando a estratégia CRISPR-Cas9 baseada em HDR (Akhmetov et al., 2018), os autores substituíram com sucesso o gene β3 da levedura analítica pelo gene β3 humano (HsPSMB3) (Figura 2c). Assim, a subunidade β2 da levedura é capaz de recrutar a subunidade β3 humana para o núcleo do proteasoma da levedura, mas a subunidade β2c humana não é capaz de desempenhar esse papel em conjunto com a subunidade β3 da levedura. Primeiro usando uma cepa humana de levedura β3, a tecnologia de edição de genes baseada em CRISPR-Cas9 agora é capaz de substituir o β2 na levedura pelo gene humano de tipo selvagem β2c (HsPSMB7). As cepas duplicadas de levedura Hsβ2c-Hsβ3 são sobrevivêveis através de PCR específica do local eSequência SangerVerificação (Figura 2d).

Assim, fornecendo sua subunidade humana vizinha, a β3 humana, o β2c humano geralmente não complementar é agora capaz de desempenhar um papel no proteasoma de levedura. No entanto, o fornecimento de β3 humano em levedura não permite que a levedura β2 se complemente com Hsβ2i. Determinações quantitativas de crescimento mostraram defeitos de adaptação moderados em cepas engenharias. As cepas humanas de Hsβ2c-S214G apresentam defeitos de crescimento sensíveis à temperatura a 23°C, enquanto as cepas humanas de Hsβ2c-T44A crescem mais lentamente a 23°C e 37°C do que as cepas selvagens. Além disso, embora as cepas humanas de Hsβ3 sejam semelhantes ao crescimento de leveduras selvagens, as cepas humanas de Hsβ2c-Hsβ3 apresentam fenótipos sensíveis à baixa temperatura a 23 ° C e crescem mais lentamente a 30 ° C em culturas líquidas.