A proteína RolR é derivada da bactéria Bacillus glutamatus e pertence à família de proteínas dissuasoras TetR. Na natureza, sua função é clara: através da identificação e combinação de "Interfenóis" (produtos químicos amplamente usados ​​na produção industrial), regula a expressão genética das bactérias, ajudando as bactérias a lidar com os Interfenóis no ambiente e a evitar os danos.

Essa "exclusividade" é uma vantagem e uma limitação na pesquisa científica. Os cientistas perceberam que, se o RolR “aprendesse” a identificar mais moléculas, poderiam ser desenvolvidos biosensores de baixo custo e de alta sensibilidade para monitoramento ambiental (por exemplo, detecção de substâncias aromáticas perigosas em águas residuais industriais), síntese de medicamentos (monitoramento em tempo real de concentrações de intermediários farmacêuticos) e até mesmo diagnóstico de doenças (identificação de marcadores moleculares relacionados a doenças).

Para que o RolR adquirisse novas capacidades, os pesquisadores usaram a tecnologia de “evolução direcionada” para simular processos evolutivos naturais e acelerar a otimização funcional em três passos chave:

O RolR identifica o fenol intermaterial por meio de um "bolso de ligante ligado", cuja forma e composição de aminoácidos determinam o tipo de molécula a que ele pode se ligar. Os pesquisadores selecionaram 19 aminoácidos-chave localizados dentro ou perto dos bolsos. As mutações precisas destes aminoácidos são realizadas através das técnicas de "Combination Active Site Saturation Test (CAST)" e "Iterative Saturation Mutation (ISM)" para criar variantes RolR massivas (Figura 1.A-C). Vale ressaltar que os pesquisadores deliberadamente mantiveram o aminoácido D149, que é a "pegadora-chave" para o reconhecimento do interphenol pela RolR, e que a mutação poderia levar à sua completa perda de função.

Apenas alguns dos bancos de variantes mutados preenchem duas condições ao mesmo tempo: a ligação normal ao gene regulador do DNA (garantindo a função básica) e a "ativação" por uma nova molécula alvo (adquirindo nova função). Os pesquisadores projetaram um sistema de "dupla seleção" usando a proteína antiporter TetA (Figura 1D, Figura 2):

Este método de triagem elimina de forma eficiente as variantes "não qualificadas", deixando, em última análise, candidatos de alta qualidade com "funções completas + novas respostas moleculares".

A equipe de pesquisa não se acabou com a primeira geração de variantes. Eles continuaram a otimizar as mutações usando as variantes que reconhecem o catecol como modelo e, finalmente, obtiveram variantes RolR que reconhecem seis novas moléculas, incluindo:

A utilidade de um biosensor depende em grande parte de sua capacidade de trabalhar em diferentes hospedeiros. A equipe "transplantou" a variante RolR modificada para a levedura vinícola, um modelo comum de eucariotismo (Figura 3), descobrindo que:

Na superfície dos resultados do estudo, o RolR modificado é aplicável entre espécies, estabelecendo a base para sua aplicação em eucariotas, como o monitoramento metabólico em fábricas de células de levedura.

Desde a identificação exclusiva de Interfenóis até a transformação do RolR em um “multifaceted” capaz de distinguir moléculas múltiplas, a transformação do RolR mostra o charme central da biologia sintética – a capacidade de dar à vida novas funções através da manipulação precisa das moléculas biológicas para resolver os problemas reais que a humanidade enfrenta. Este conjunto de estruturas de evolução direcionada é aplicável não apenas ao RolR, mas também a outras proteínas de ligação a aTF e ligantes, abrindo a porta para o desenvolvimento de biosensores mais "personalizados". Talvez, em um futuro próximo, esses pequenos sensores de proteínas possam entrar em nossas vidas como “guardiões invisíveis” do meio ambiente, da saúde e da produção industrial.