I. Introdução ao sistema de expressão de levedura Bichi

Sistema de expressão de Pichia pastoris Como um sistema altamente eficiente de expressão eucariotica, o sistema de expressão de Pichia pastoris tem uma ampla gama de áreas de aplicação e vantagens significativas. As vantagens do sistema de expressão de levedura de Bich são evidentes em comparação com outros sistemas de expressão. Ele possui um dos promotores mais fortes e reguladores atualmente, o promotor AOX1 do gene da alcool oxidase, o que torna a regulação da expressão de genes estrangeiros mais precisa e eficiente. Seu alto nível de expressão pode alcançar tanto a expressão intracelular quanto a expressão secreta, o que satisfaz enormemente as necessidades de diferentes pesquisas e produção. O processo de fermentação é maduro e fácil de ampliar, e já possui a capacidade de produção industrial de alta densidade em massa, proporcionando condições convenientes para o desenvolvimento da industrialização. Custos de cultivo baixos, produtos fáceis de separar, meios de fermentação usados ​​são baratos e não contêm proteínas, favorecendo a purificação de separação de produtos a jusante, reduzindo os custos de produção. Os genes de proteínas estrangeiras são geneticamente estáveis ​​e, após a integração no cromossoma da levedura de Bichi, podem ser estáveis ​​com a replicação cromossómica e não são fáceis de perder. Além disso, como um sistema de expressão eucariotica, a levedura Bichi também tem a estrutura subcelular do eucariotismo, capaz de processar a proteína expressa após a glicosilação, acilação de gordura, fosforilação de proteína, etc., tornando a proteína expressa estruturalmente e funcionalmente mais próxima das proteínas naturais e com maior atividade biológica.

II. Composição do sistema de expressão de levedura de Bichi

1 - Bactérias hospedeiras

A maioria dos hospedeiros de leveduras de Bicchi usados ​​atualmente para expressão de proteínas exóticas são: Mut + metanol, GS115, X-33, SMD1165, SMD1163 e SMD1168; MutS metanol usando a forma lenta KM71; Mut-metanol não utiliza o tipo MC100-3. Veja a tabela abaixo para uma lista detalhada das diferentes formas de expressão e características da levedura de Bich.

Tabela 1 Os hospedeiros comuns de expressão de levedura de Bich e características

Variedades	Características
GS115	Com altos níveis de expressão, alta densidade celular, alta produção de proteínas solúveis, bactérias hospedeiras atualmente amplamente usadas
O KM71	O metanol é usado em forma lenta para expressar proteínas difíceis de dissolver
X33	Aumenta a expressão e a atividade para a expressão de proteínas recombinantes
SMD1168H	Melhor eficiência de expressão e maior densidade celular para a expressão de proteínas macromoleculares
SMD116 (hi4 pep4)	Pertencendo a uma cepa de protease deficiente, é capaz de reduzir a degradação das proteínas e resolver a distribuição desigual dos produtos de expressão devido à degradação das proteínas, embora a cepa cresça relativamente lentamente, o que pode levar a uma menor produção de proteínas exógenas expressas.
O Y-11430	Capacidade de expressão eficiente e com expressão regulada

2 - Transportadores

Os veículos de expressão de levedura Bich são predominantemente veículos integrados, e os veículos comuns podem ser divididos em veículos de expressão intracelular e veículos de expressão secreta.

Tabela 2 Vetores e características comuns de expressão de levedura de Bich

III. Processo de fermentação de levedura de Bichi

1 - Fase da fermentação da levedura

A fermentação da levedura de Bicchi geralmente é dividida em duas fases: 1, fase de crescimento celular: a primeira fase de crescimento realizada em meio de cultura com fonte de carbono como glicerina ou glicose, acumular densidade celular e biomassa suficientes, quando a concentração bacteriana atinge um certo estágio, quando a glicerina ou a glicose se esgotam, levará ao aumento súbito do oxigênio dissolvido para cerca de 100%, em seguida, começará a fluir a solução de glicerina ou glicose, e mantenha a ventilação e a velocidade de agitação para manter os níveis de oxigênio dissolvido em cerca de 30%, aumentando ainda mais a biomassa (concentração bacteriana). Fase de indução: quando a biomassa atingir os requisitos, para a fonte de reposição de carbono, a fonte de carbono está esgotada, após o fim do período de transição, a fonte de carbono é trocada para o metanol para a fase de fermentação da expressão induzida da proteína alvo. A adição de metanol 0,3% é geralmente induzida duas vezes em intervalos e, em seguida, começa a expressão de proteínas induzidas por metanol, de uma forma que aumenta os níveis de expressão de proteínas exóticas e permite que a levedura de Beech acumule altas concentrações de proteínas alvo em um período mais curto.

A fase de expressão induzida é um elemento-chave no processo de produção de fermentação de levedura de Bich, na qual o metanol é usado como indutor específico em substituição da fonte de carbono anterior. Os genes da alcool oxidase em leveduras de Beech, como AOX1, são ativados na presença de metanol, conduzindo assim a expressão eficiente de genes exóticos. O controle das condições nesta fase tem um impacto importante na produção e qualidade das proteínas exóticas e exige um controle rigoroso da quantidade de metanol adicionado, taxa de adição e parâmetros como temperatura, pH e oxigênio dissolvido no ambiente de fermentação para garantir a expressão contínua e eficiente dos genes exóticos, evitando ao mesmo tempo a toxicidade do metanol para as células e outros efeitos adversos.

Tipos e fórmulas de meios de fermentação

A variedade de meios de fermentação de levedura de Bich é variada e diferentes fórmulas de meios de cultura são adequadas para diferentes estágios e fins de fermentação.

O meio de cultura BSM (sal básico) é um dos meios básicos comumente usados ​​para a fermentação de levedura de Bich, com a fórmula típica de: ácido fosfórico a 85% 26,7 ml / l, sulfato de cálcio dihidrato 0,93 g / l, sulfato de potássio 18,2 g / l, sulfato de magnésio heptahidrato 14,9 g / l, hidroxido de potássio 4,13 g / l, glicerina 40,0 g / l, PTM1 4,35 ml / l. Este meio fornece nutrientes essenciais para o crescimento da levedura de Bich, incluindo sales inorgânicos como nitrogênio, fósforo, potássio, magnésio e glicerina como fonte de carbono, enquanto o PTM1 complementa nutrientes como oligoelementos e vitaminas necessários para o crescimento da levedura, ajudando a manter o crescimento normal e o metabolismo das células da levedura.

O meio F22 também é um meio comum de fermentação de levedura de Bich, cuja formulação pode ser ajustada em diferentes aplicações de pesquisa e produção, mas geralmente contém quantidades apropriadas de fontes de carbono (como glicerola ou glicerola), fontes de nitrogênio (como extratos de levedura, proteína de manga, etc.), sais inorgânicos (como sulfato de magnésio, cloreto de cálcio, fosfato de dihidropotássio, etc.) e outros aditivos (como biotina, soluções de oligoelementos, etc.). Em comparação com os meios BSM, os meios F22 podem ser otimizados em termos de composição e proporção de nutrientes para atender a necessidades específicas de fermentação, por exemplo, em alguns casos podem ser mais favoráveis para melhorar a expressão de proteínas exógenas ou melhorar a qualidade das proteínas.

Além dos dois meios comuns mencionados acima, existem muitos outros meios de fermentação de levedura de Bich, que muitas vezes são otimizados e ajustados para fins experimentais específicos, características da cepa e requisitos do processo de fermentação. Por exemplo, em alguns estudos, para melhorar a eficiência da utilização da levedura de Bicchi de substâncias específicas ou aumentar a sua tolerância à pressão ambiental, alguns componentes especiais, como aminoácidos, ácidos orgânicos, poliaçúcares, etc., são adicionados ao meio de cultura; Ou, ajustando a proporção de carbono, nitrogênio e sal inorgânico no meio para otimizar o crescimento e as vias metabólicas das células de levedura, permitindo uma maior eficiência de fermentação e rendimento do produto.

Parâmetros do processo de fermentação

O controle preciso dos parâmetros do processo, incluindo pH, temperatura, oxigênio dissolvido, etc., são essenciais para o sucesso da fermentação durante o processo de fermentação de levedura de Beech, que se relacionam e interagem para determinar o estado de crescimento da levedura de Beech, a atividade metabólica e o nível de expressão de proteínas exógenas.

pH: é um dos fatores-chave que afetam a fermentação da levedura de Bich. As leveduras de Beech exigem diferentes valores de pH em diferentes estágios de crescimento e processos metabólicos. Na fase de crescimento celular, a faixa de pH geralmente apropriada é de 5,0 - 6,0, nesta condição de pH, as células de levedura podem manter um bom estado de crescimento, a atividade enzimática também pode ser melhor desempenhada, favorecendo a proliferação celular e a acumulação de metabólicos. O pH no processo de fermentação da levedura de Beech não só afeta o estado de crescimento da bactéria, mas também tem um impacto importante na expressão de proteínas exóticas. O efeito do pH sobre a levedura de Bich inclui principalmente os seguintes aspectos: (1) afetar a atividade das enzimas intracelulares e, por sua vez, afetar o metabolismo celular, afetando assim a expressão de proteínas exógenas; (2) afetar a permeabilidade da membrana celular e ter um certo efeito na absorção de nutrientes e eliminação de metabólicos pelas células; (3) o pH afetará a dissolução dos componentes no meio de cultura e dos metabólitos das células, afetando assim a absorção de nutrientes pelas células; (4) o pH também pode ter um efeito no processo metabólico da célula, fazendo com que o conteúdo do metabólico celular mude, além disso, no processo de fermentação de alta densidade, a fim de reduzir a degradação de proteínas estrangeiras por proteases, o valor de pH mais adequado para a protease deve ser evitado, o valor de pH deve ser definido em desvios de proteínas estrangeiras e outros pontos elétricos, também aumentará a taxa de colheita de proteínas estrangeiras.

Temperatura: também tem um efeito significativo no crescimento e no metabolismo da levedura de Beech. A temperatura de crescimento da levedura de Bichi é geralmente mais adequada entre 28 e 30 ° C. Nesta faixa de temperatura, as células de levedura crescem mais rápido, têm atividade metabólica intensa e são capazes de usar os nutrientes no meio de cultivo para crescer e se reproduzir de forma eficiente. No entanto, uma temperatura excessiva, acima de 32 graus Celsius, pode levar à morte celular, uma vez que as temperaturas altas danificam a estabilidade de biomacérculas como membranas, proteínas e ácidos nucleicos, afetando a função fisiológica normal da célula. Em vez disso, em temperaturas mais baixas, embora as células cresçam mais lentamente, alguns estudos mostram que reduzir adequadamente a temperatura da cultura pode melhorar o rendimento e a qualidade da proteína alvo. Isso ocorre porque a temperatura baixa pode reduzir o estresse no dobramento das proteínas dentro da célula, reduzindo a ocorrência de dobramentos errados, ao mesmo tempo que pode reduzir a atividade das proteases e reduzir o grau de hidrolise das proteínas exóticas, favorecendo assim o dobramento e a acumulação corretos das proteínas exóticas.

Oxigênio dissolvido (OD): é outro parâmetro de processo fundamental no processo de fermentação de levedura de Bich. A levedura de Bicchi requer a participação do oxigênio ao usar glicerina e metanol para o crescimento e o metabolismo, portanto, manter os níveis adequados de oxigênio dissolvido é essencial para garantir que a fermentação ocorra sem problemas. Durante todo o processo de fermentação, geralmente é necessário manter a concentração de oxigênio dissolvido em níveis > 20%. No início do crescimento celular, devido ao menor número de bactérios, a necessidade de oxigênio é relativamente baixa, quando a necessidade de oxigênio dissolvido da célula pode ser atendida através da ventilação e agitação adequadas. À medida que o crescimento celular e a atividade metabólica aumentam, o consumo de oxigênio aumenta gradualmente, e é necessário ajustar ainda mais o volume de ventilação, a velocidade de agitação ou a utilização de suplementos de oxigênio puro para aumentar os níveis de oxigênio dissolvido para garantir que as células possam obter oxigênio suficiente para o metabolismo. A falta de oxigênio dissolvido pode levar ao crescimento celular lento, a redução da acumulação de metabólicos e até mesmo à morte celular, afetando gravemente a eficiência da fermentação e o rendimento do produto.

Tempo de cultivo: é um dos fatores mais críticos para obter os mais altos níveis de expressão de proteínas no sistema de expressão de leveduras de Beech, onde o tempo de produção é relativamente longo (cerca de 100 h). O tempo de cultivo está relacionado com o número de células de levedura e o grau de degradação da proteína alvo. Alguns estudos sugerem que a densidade de crescimento máxima das células de levedura de Pasterbich é de cultivo de 96h, enquanto a expressão máxima de proteína ocorre em 48h [11], o que sugere que o tempo de cultivo mais longo provavelmente levará à hidrolise da proteína expressa, e outros estudos sugerem que o tempo de expressão óptima de proteína ocorre em cultivo de 72 a 96 h [2]

O processo de fermentação de leveduras de Beech é um processo complexo e sofisticado que requer um controle preciso e otimização das fases de fermentação, fórmulas de meio e parâmetros de processo. As condições de fermentação, como pH, temperatura, oxigênio dissolvido e composição de meio de cultura, podem ser otimizadas sistematicamente através de métodos de design experimental (DOE) para obter a expressão e produção eficientes de proteínas exóticas. Através de uma compreensão aprofundada das características e necessidades de fermentação da levedura de Picchu, combinando tecnologias e equipamentos de fermentação avançados e otimizando constantemente o processo de fermentação, é esperado melhorar ainda mais a eficiência e a qualidade do produto da fermentação da levedura de Picchu.

IV. “Compatibilidade silenciosa” da levedura de Bichi e do tanque de fermentação

Durante o processo de fermentação da levedura de Beech, o tanque de fermentação, como equipamento central, fornece condições ambientais críticas para o crescimento e o metabolismo da levedura de Beech, garantindo que ela possa expressar proteínas estrangeiras de forma eficiente.

Os tanques de fermentação fornecem a temperatura de crescimento adequada para a levedura de Bich através de um sistema de controle de temperatura preciso. Como mencionado anteriormente, com a levedura de Beech na fase de crescimento de 28 - 30 ° C e os requisitos específicos para a temperatura na fase de expressão induzida, o sistema de controle de temperatura do tanque de fermentação é capaz de manter-se com precisão nestas faixas de temperatura de configuração, evitando efeitos adversos de temperaturas excessivamente altas ou baixas no crescimento celular da levedura e na expressão de proteínas. Este controle preciso da temperatura é particularmente importante na produção de fermentação em massa, que garante que cada lote de levedura de Beech cresça em um ambiente de temperatura estável e adequado, aumentando assim a estabilidade e a repetibilidade da produção.

Para a regulação do pH, os tanques de fermentação são equipados com dispositivos avançados de detecção e regulação do pH. Em diferentes estágios da fermentação da levedura de Bich, o tanque de fermentação é capaz de adicionar automaticamente uma solução ácido-alcalina, mantendo o pH exatamente no intervalo desejado. Mantendo o pH de 5,0 a 6,0 durante a fase de crescimento celular e induzindo o ajuste da fase de expressão para 3,0 a 5,0, este controle preciso do pH ajuda a manter a atividade enzimática dentro das células de levedura, promovendo o crescimento e o metabolismo normais das células, ao mesmo tempo que reduz a degradação de proteínas estrangeiras e melhora o rendimento e a qualidade das proteínas.

O controle dos níveis de oxigênio dissolvido também é uma das funções chave do tanque de fermentação. A levedura Bich tem uma alta necessidade de oxigênio dissolvido durante o processo de fermentação, e o tanque de fermentação garante que a concentração de oxigênio dissolvido seja sempre mantida em > 20% através de um sistema de ventilação e um dispositivo de agitação razoáveis. O sistema de ventilação pode entrar uniformemente em ar ou oxigênio no líquido de fermentação, enquanto o dispositivo de agitação é agitado constantemente para que o oxigênio se disperse completamente no líquido de fermentação, melhorando a eficiência da transmissão de oxigênio, satisfazendo a necessidade de oxigênio da levedura de Beech em diferentes estágios de crescimento, garantindo a execução normal de sua atividade metabólica e promovendo a expressão eficiente de proteínas exógenas.

A sinergia do sistema de agitação e ventilação também garante a distribuição uniforme dos nutrientes no líquido de fermentação, evitando deficiências ou excessos locais de nutrientes, permitindo que cada célula de levedura de Bichet cresça em um ambiente nutricional adequado. Ao mesmo tempo, o desempenho de vedação do tanque de fermentação também é muito importante, é capaz de prevenir a poluição por gerígenas externos, garantir a pureza e a estabilidade do processo de fermentação de levedura de Bichi, evitar problemas como falhas de fermentação causadas ​​por gerígenas ou queda da qualidade do produto.

Os produtos do tanque de fermentação da Jin Wei Bio são projetados e fabricados com base nestas necessidades-chave, com controle avançado de temperatura, regulação de pH, controle de oxigênio e sistema de agitação e ventilação eficiente, podem fornecer condições ambientais otimizadas para a fermentação de levedura de Bichi, ajudando os usuários a alcançar uma produção de fermentação de levedura de Bichi eficiente e estável, seja na fase de teste em laboratório ou na produção em massa industrial, o desempenho pode ser desempenhado, para atender às diversas necessidades de diferentes usuários de fermentação de levedura de Bichi e ajudar a prosperar a indústria de biotecnologia. Continuaremos a prestar atenção à dinâmica da pesquisa e às necessidades de aplicação da levedura de Beech, otimizando e inovando constantemente o projeto e a tecnologia de fabricação de tanques de fermentação, melhorando o desempenho e a estabilidade dos tanques de fermentação, fornecendo suporte a equipamentos mais avançados e eficientes para a produção de fermentação de levedura de Beech e impulsionando juntos a indústria de biotecnologia para um futuro mais brilhante.

Introdução ao tanque de fermentação
Jimway-be ® Série Lab ------ Reatores de nível desktop

Jimway-be ® Série PM ------ Bioreatores Multiligados

Aplicação: Cultura e fermentação e expressão de células protonucleosas / eunucléarias

Volume do prato Petri: 250ml / 500ml / 1L / 3L / 5L / 10L

Número de unidades: 2-16

Método de cultivo: Suspensão e adesão

Tipo de remo: combinações de três, seis, seis, semi-tubo, remo elevador, etc.

Modo de transmissão: accionamento de acoplamento magnético / agitação mecânica

Estratégia de controle: PID & estratégia de controle escaladeiro (suplemento, velocidade de agitação, temperatura, ventilação, etc.)

Controle de suplemento: controle de suplemento preciso (erro ± 1g)

Características:

Interface simples: alguns minutos para dominar a operação, metade do trabalho

Descontrolado: acessível remotamente, operacional e desocupado

Função de fórmula: fórmula com um clique, reduzir os erros de operação do pessoal, melhorar a qualidade

Análise de dados: comparação de vários lotes de dados e análise multivariável profunda externa do Doe&PAT para otimizar os dados de processo

Compartilhamento de dados: Publicação web baseada em VPN para monitoramento e visualização de curvas de histórico em dispositivos móveis (Android, IOS, Windows) com segurança de dados e dispositivos