Em sistemas de detecção de analisadores de aminoácidos, a derivação pós-coluna é um passo fundamental para a conversão de aminoácidos separados por coluna cromatográfica em derivados que podem ser detectados com alta sensibilidade, enquanto a detecção de fluorescência é um meio central para a análise quantitativa de aminoácidos capturando sinais fluorescentes de derivados. A combinação dos dois pode resolver o problema do "sinal de fluorescência fraco dos próprios aminoácidos livres, difícil de detectar diretamente a alta sensibilidade", é a combinação da tecnologia principal da análise moderna de aminoácidos (especialmente a análise de vestígios), o seu princípio pode ser desmontado em "mecanismo de reação derivada pós-coluna" e "princípio óptico de detecção de fluorescência", especificamente como segue:
Princípio da derivação pós-coluna: converter "aminoácidos difíceis de detectar" em "derivados fáceis de detectar"
As moléculas de aminoácidos (exceto a triana) não possuem grupos de absorção UV ou emissão de fluorescência fortes e têm uma sensibilidade extremamente baixa na detecção direta (incapaz de atender às necessidades de análise de traços de nível μg / L). A lógica central da derivação pós-coluna é que os aminoácidos separados por coluna de cromatografia de troca iónica (padrão de separação comum para análise de aminoácidos) reagem químicamente com um "reagente derivado" específico após a coluna de saída para gerar derivados estáveis com forte fluorescência (ou absorção ultravioleta forte), criando as condições para a detecção subsequente de alta sensibilidade.
Processo principal: separação → mistura → reação → detecção
O sistema derivado pós-coluna é composto por "tanque de armazenamento de reagentes derivados, misturador, recipiente de reação, dispositivo de controle de temperatura", os passos específicos são:
Separação de aminoácidos: vários aminoácidos na amostra são separados pela coluna de troca iônica (como a resina de troca iônica de sulfato), devido às diferenças de afinidade entre os diferentes aminoácidos e a resina, fluindo da coluna em uma ordem específica;
Mistura de reagentes: o fluxo de aminoácidos após a separação (fase de fluxo + aminoácidos) é misturado adequadamente com fluxos de reagentes derivados (por exemplo, tritrona, ftal diformaldejido OPA, 9-metilcloroformato FMOC) através de um "misturador tipo T";
Reação termostática: a mistura entra no "tubo de reação de temperatura controlada" (geralmente 30-130 ° C, dependendo do reagente), a reação derivada ocorre a uma temperatura específica, gerando derivados fluorescentes;
Detecção de entrada: o derivado após a reação flui diretamente para o detector de fluorescência para captura de sinal.
Princípio da detecção de fluorescência: captura de sinais fluorescentes derivados para realizar análise quantitativa
A detecção de fluorescência baseia-se no fenômeno "fotoluminescente": quando o derivado fluorescente é exposto a luz de um comprimento de onda específico (luz excitada), os elétrons na molécula absorvem energia e saltam para um nível de energia elevado, depois liberando parte da energia através de um salto não radiante, voltando ao estado básico e emitindo luz de um comprimento de onda específico (fluorescência). O detector de fluorescência converte a intensidade da fluorescência em sinais elétricos por meio da "filtragem de luz excitada, coleta de fluorescência e conversão de sinal", o que finalmente permite a análise quantitativa dos aminoácidos.
Estrutura central e fluxo de trabalho do detector de fluorescência
O detector de fluorescência é composto principalmente por "fonte de luz, monocroma de excitação, piscina de amostras, monocroma de emissão, tubo fotoelétrico multiplicador (PMT), processador de sinal", os passos específicos são os seguintes:
Produção de luz excitada: a luz composta emitida pela fonte de luz (lâmpada xenônica comumente usada, que fornece um espectro contínuo de 200-800nm), filtrada por um "monocromático excitado" (composto por rastres e fendas), mantendo apenas a luz monocromática correspondente ao "comprimento de onda excitado" do derivado (por exemplo, o derivado OPA corresponde à luz excitada de 340nm);
Excitação e emissão de fluorescência: excitação da luz através da piscina da amostra (que flui através da solução derivada após a coluna), a molécula derivada absorve a energia e emite fluorescência (direção da fluorescência é vertical à luz excitada para evitar a interferência da luz excitada);
Filtração e coleta de fluorescência: a fluorescência emitida é filtrada pelo "monocromático de emissão" (eliminando a luz dispersa e a luz excitada não absorvida), mantendo apenas a luz monocromática correspondente ao "comprimento de onda de emissão" do derivado (por exemplo, o derivado OPA corresponde à luz emitida de 450 nm);
Conversão e quantificação do sinal: a fluorescência filtrada é recebida pelo "tubo fotoelétrico multiplicador (PMT)", o PMT converte um sinal óptico fraco em um sinal elétrico proporcional (corrente ou tensão), amplificado pelo processador de sinal, após a conversão modular, para gerar um cromatograma de "intensidade de fluorescência - tempo de retenção";
Bases quantitativas: de acordo com a "forma estendida de fluorescência da lei de Lambert-Beer" - dentro de uma determinada faixa de concentração, a intensidade de fluorescência dos derivados de fluorescência é proporcional à concentração de aminoácidos, a concentração de cada aminoácido na amostra pode ser calculada comparando a "intensidade de fluorescência dos derivados de aminoácidos padrão (curva padrão)" com a "intensidade de fluorescência dos derivados da amostra".
Vantagens principais da detecção de fluorescência: alta sensibilidade e alta especificidade
Em comparação com a detecção de absorção ultravioleta, a detecção de fluorescência tem uma vantagem insubstituível na análise de aminoácidos, que é a principal razão pela qual a derivação pós-coluna é frequentemente associada à detecção de fluorescência:
Alta sensibilidade: o limite de detecção (LOD) da detecção de fluorescência pode atingir o nível nmol / L ou mesmo pmol / L (1-3 graus de quantidade mais baixos do que a detecção UV), que pode detectar traces de aminoácidos em amostras biológicas (como sangue, urina) (como aumento de traces de aminoácidos causado por anormalidades metabólicas);
Alta especificidade: só pode detectar "derivados que produzem fluorescência", e a fase de fluxo, as impurezas (se não reagirem com o reagente derivado) quase sem sinal de fluorescência, pode evitar eficazmente a interferência do pico (como a análise de aminoácidos após hidrólise de proteínas em alimentos, sem a necessidade de tratamento pré-complexo de desinfecção);
Ampla gama linear: na faixa de concentração de 104-105, a intensidade de fluorescência tem uma boa relação linear com a concentração de aminoácidos e é apropriada para a quantificação de amostras de diferentes conteúdos (de traços a constantes).
Lógica sinérgica da derivação pós-coluna e da detecção de fluorescência (por que é necessário combinar?)
A combinação dos dois resolve perfeitamente o ponto de dor "separação-detecção" da detecção de aminoácidos, formando um círculo fechado:
A derivação pós-coluna é realizada após a separação dos aminoácidos pela coluna cromatográfica, o reagente derivado não reage com as impurezas na amostra (como proteínas, sais) (as impurezas foram separadas pela coluna cromatográfica ou não possuem aminos), evitando a "separação do efeito das impurezas derivadas" (a derivação pré-coluna pode causar picos de sobreposição devido à co-lavagem dos derivados e impurezas);
Fluorescença pós-derivada, aumento da sensibilidade: transformar "aminoácidos não fluorescentes" em "derivados fluorescentes fortes" através da derivação, permitindo que a detecção de fluorescência capture sinais fracos e atenda às necessidades de análise de vestígios (por exemplo, detecção precisa do espectro metabólico de aminoácidos no diagnóstico clínico);
O sinal é ligado à concentração para alcançar a quantificação: a intensidade da fluorescência é proporcional à concentração do derivado (ou seja, a concentração do aminoácido original), combinando a curva padrão para quantificar com precisão o conteúdo de cada aminoácido, o resultado é repetitivo (RSD geralmente < 2%).