No campo da caracterização de nanopartículas,Tamanho da partícula、ConcentraçãoParâmetros como potencialDeterminação precisaÉ um elemento central para garantir o sucesso da pesquisa e aplicação. Artigo anterior Compartilhamos detalhes「Parâmetros comuns na detecção de nanopartículasa obtenção precisa desses parâmetros não só ajuda a analisar em profundidade as propriedades físicas e químicas dos nanomateriais, mas tambémBiomedicina, Ciências dos Materiais, Ciências AmbientaisA aplicação prática em tais áreas fornece uma base fundamental. No entanto,Precisão, confiabilidade, repetibilidade e reprodutividade dos dados de mediçãoApenas confiar em equipamentos de instrumentos avançados não é suficiente, mas também é necessário passar por um rigoroso processo de verificação para garantir o desempenho do instrumento e as especificações operacionais. Isto é...3QCertificação (IQ, OQ e PQ)A importância está na caracterização das nanopartículas.

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Certificação 3QConteúdo e significado

Certificação 3Q: Confirmação de Instalação (IQ), Confirmação de Operação (OQ) e Confirmação de Desempenho (PQ)É um conjunto internacional de procedimentos de validação para garantir que os instrumentos de análiseConformidade da instalação, estabilidade operacional e confiabilidade do desempenho de mediçãoO processo é claramente definido no Código de Gestão da Qualidade da Produção de Farmacêuticos (GMP) e é amplamente utilizado em várias áreas, incluindo farmacêutica, equipamentos médicos e ciência de materiais.^[1]A certificação 3Q fornece uma estrutura padronizada para o uso e a manutenção de instrumentos em áreas relacionadas com a biomedicina, garantindo que os instrumentos forneçam consistentemente dados precisos e confiáveis ​​na instalação, operação e aplicações práticas.^[2]- É.

No campo da caracterização de nanopartículas,A certificação 3Q não apenas regula a instalação e a operação dos instrumentos, mas também garante a ciência e a repetibilidade dos dados através de um processo de validação sistemático.Este artigo será lido em detalhesO núcleo da certificação 3Q e sua implementação específica na caracterização de nanopartículasconteúdoExplore como melhorar a confiabilidade dos instrumentos através de sistemas de validação rigorosos e contribuir para o desenvolvimento de alta qualidade de nanociência e aplicações industriais.

Qualificação de instalação (IQ)

IQ é o processo de inspeção sistemática e validação do processo de instalação de um instrumento de caracterização de nanopartículas.O objetivo é garantir que a instalação do instrumento atenda aos padrões de projeto do fabricante e aos requisitos de uso do usuário através de registros documentais e inspeções físicas. Isso inclui auditoria de documentos, confirmação do ambiente de instalação e confirmação de componentes do instrumento.

• Auditoria de documentosVerifique se o manual de instalação do instrumento, o manual do usuário, o manual de manutenção e outros documentos estão completos. Verifique o nome, o modelo, o número de série e outras informações básicas do instrumento para garantir a consistência com a lista de compra. Verifique se o ambiente de instalação do instrumento está em conformidade com os requisitos de projeto, incluindo temperatura, umidade, energia, etc.
• Confirmação do ambiente de instalaçãoGarantir que as condições ambientais no local de instalação (por exemplo, escape, controle de temperatura e umidade, fornecimento de energia, etc.) atendam aos requisitos operacionais do instrumento. Verifique se a segurança elétrica, a segurança mecânica e a segurança ambiental dos instrumentos estão em conformidade com as normas relevantes.
• Confirmação de peças do instrumentoVerifique se os componentes individuais do instrumento estão instalados corretamente e se a conexão está firme. Verifique se a calibração e depuração do instrumento foram concluídas e se todas as funções estão funcionando corretamente.

Através do IQ, as etapas básicas para garantir a instalação correta do instrumento de acordo com os padrões de projeto fornecem as pré-condições para a confirmação subsequente da operação e do desempenho.

Qualificação operacional (OQ)

O QI é o processo de verificação de que um equipamento e um instrumento funcionam corretamente dentro do limite de operação prescrito, geralmente em condições de funcionamento vazias ou analógicas, após a conclusão do QI, e de garantir que seus parâmetros funcionais e de desempenho atendam aos indicadores técnicos predefinidos pelo fabricante.O objetivo principal do OQ é verificar se as funções do instrumento atendem aos requisitos de projeto e verificar sua estabilidade e consistência em condições de operação padrão.

No entanto, a medição confiável do instrumento em condições experimentais reais não é garantida apenas por OQ, o que leva à necessidade de PQ.

Qualificação de Desempenho (PQ)

Após a conclusão bem-sucedida do QO, o instrumento foi identificado como funcionando de forma estável dentro da faixa operacional especificada e com capacidade para realizar tarefas de medição. EO PQ é o processo de verificação de que o instrumento pode atingir o desempenho esperado em condições reais de uso, com o objetivo de garantir que o instrumento possa fornecer resultados de medição precisos de forma contínua e estável em condições reais de experimento e processo.

No trabalho de validação diário, o OQ e o PQ tendem a ser facilmente confundidos. Para facilitar a comparação, usamos a tabela abaixo para resumir a diferença entre os dois.

A tabela acima não é difícil de entender, o objetivo principal do PQ é testar o desempenho do equipamento em condições reais de produção para garantir que o equipamento possa atingir de forma estável os padrões de desempenho estabelecidos e atender aos requisitos de produção do produto. A certificação PQ é um passo-chave no processo de validação do equipamento, a sua importância é refletida nos seguintes aspectos: 1, redução do risco: através do PQ, garantir o funcionamento seguro e confiável do equipamento em aplicações reais e reduzir o risco de qualidade; Conformidade: cumprir regulamentos internacionais e padrões da indústria, como GMP (especificações de gestão da qualidade da produção de medicamentos), ISO 13485, etc., para melhorar a conformidade das empresas; Melhoria da qualidade: verificar a função e o desempenho do equipamento para garantir que o processo de produção atenda aos requisitos esperados, melhorando assim a qualidade do produto.Para equipamentos instrumentais, geralmente o IQ e o OQ podem ser fornecidos pelo fornecedor do equipamento como produtos e serviços, enquanto o PQ, em princípio, precisa ser executado pelo usuário do equipamento ou pela unidade de aplicação com amostras reais de acordo com o processo real.

Os equipamentos de detecção de nanopartículas pertencem a instrumentos de medição de precisão, e os dados de teste se referem a uma série de trabalhos de pesquisa científica e produção subsequentes. Através da rigorosa certificação PQ, a capacidade de teste do instrumento pode ser fundamentalmente determinada e tem uma orientação importante sobre como ver corretamente os dados de teste do instrumento no futuro. Para instrumentos de caracterização de precisão, quais aspectos da certificação PQ incluem a validação experimental? Em seguida, vamos explorar os experimentos-chave na certificação PQ e seu impacto na qualidade dos dados.

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RelacionadoVerificação PQParâmetros-chave

Precisão (Accuracy)

No PQ,A precisão éResultados da medição do instrumento (valor medido)com o valor real(Verdadeiroem value)ou valor de referência(AceitadorEferênciaem value)a proximidade entre eles.De acordo com as mais recentes »ICH Validação de procedimentos analíticos Q2(R)2) A definição da guia de validação do método analítico, a precisão reflete o "grau de proximidade do valor real" do método de medição, a avaliação é a exatidão dos resultados da medição do instrumento, um dos indicadores mais centrais para avaliar o desempenho do instrumento.

Na caracterização de nanopartículas, a precisão é geralmente medida porMaterial de referência certificado (CRM) ou com outros métodos(por exemplo, TEM de detecção de tamanho de partícula) para comparação para avaliar. Em outras palavras, a precisão reflete se o desvio dos dados obtidos pelo instrumento está dentro de uma faixa aceitável ao medir parâmetros alvo, como tamanho de partícula, concentração ou potencial zeta de uma nanopartícula. A precisão pode ser usada em experimentos químicos e biomédicos analíticosRecuperação (Recovery)Esse parâmetro é avaliado. Representa a proporção em que o analítico alvo foi obtido ou detectado com sucesso a partir da amostra durante o processo experimental. A fórmula de cálculo é:

Idealmente, a taxa de recuperação deve ser próxima de 100%, indicando que o método experimental é capaz de extrair ou detectar o analítico alvo. O desvio da taxa de recuperação de 100% reflete um erro sistemático (viés) no método experimental. Em aplicações práticas, a faixa aceitável de taxas de recuperação é geralmente determinada de acordo com as necessidades experimentais e os padrões da indústria. Por exemplo, na bioanálise, a taxa de recuperação é geralmente exigida entre 80% e 120%.^[6]- É.

Além do mencionado acima através de CRM, etc.Comparação de materiais (Comparação de materiais de referência)Além do método, a avaliação da precisão também é frequentemente usada.Estudo de Spiking (Spiking Study)- Adicionar artificialmente uma quantidade conhecida de analítico (ou seja, um analítico interno, comumente chamado de CRM) a uma matriz que não contém essa substância ou enriquecer uma amostra de ensaio e, em seguida, medir usando um método analítico a verificar e comparar os desvios entre os resultados medidos e a quantidade teórica adicionada (ou o valor teórico adicionado ao analítico interno) (se a taxa de recuperação for excessivamente desviada, isso pode indicar que a composição da matriz está interferindo com a medição e que é necessário otimizar o método ou corrigir o efeito da matriz); Ou avaliando amostras não marcadas e marcadas/enriquecidas, respectivamente, para avaliar a precisão da detecção (do método ou do equipamento) de componentes que não são marcados na amostra misturada.

Além disso, quando não é possível obter todos os componentes relevantes para construir uma matriz correspondente para experimentos de marcação, os pesquisadores também podem adotarMétodo ortodoxo (Ortogonalprocedimentos,Refere-se ao uso de um método de análise independente diferente dos princípios do método principal para medir a mesma amostra e verificar a confiabilidade do método principal através da comparação dos resultados.）Verificar a precisão dos principais métodos de medição.

Precisão (Precisão)

Precisão refere-se a medições repetidas nas mesmas condições experimentais.Um conjunto de dados na mesma amostraentreDiscretograu, ou seja, a consistência dos resultados da medição.A precisão é medida pela repetibilidade e reprodutividade do método, e não pela precisão dos dados. Tome o tiro de alvo como exemplo (Figura abaixo): quanto maior a precisão, menor a volatilidade do método de ilustração, mais estável o resultado da medição, mas não necessariamente preciso (perto do alvo); Da mesma forma, os dados de alta precisão não são necessariamente estáveis e a reprodutividade dos dados de detecção não é necessariamente alta. A precisão e a precisão podem ser avaliadas de forma independente ou combinada, mas cada um requer critérios de aceitação pré-definidos.

De acordo com a ICH Q2(R2), a precisão pode ser dividida em três categorias:

• Repetibilidade(Repetibilidade)Precisão das medições obtidas em um curto período de tempo repetido no mesmo laboratório, no mesmo operador, no mesmo instrumento e nas mesmas condições. Usando o teste de concentração de partículas como exemplo, recomenda-se (a) definir pelo menos nove testes, ou seja, três concentrações diferentes, cada concentração repetida três vezes; Ou (b) repetir o ensaio pelo menos seis vezes em uma concentração fixa para avaliar a repetibilidade.
• Precisão Intermédia (Intermediate Precision)Precisão das medições realizadas no mesmo laboratório, mas com diferentes operadores, diferentes horários ou diferentes condições de instrumento. O escopo específico do experimento de validação requer que o validador seja determinado de acordo com o cenário de aplicação real. Em outras palavras, nem todos os casos exigem que cada variável seja testada individualmente, nem necessariamente que todas as variáveis sejam testadas de forma exhaustiva, mas sim que os fatores aleatórios que podem afetar a precisão da medição sejam avaliados de acordo com as necessidades reais e que os projetos experimentais sejam validados de acordo com o desenvolvimento de produção e a avaliação de risco. De acordo com diferentes fatores de avaliação e projetos experimentais, a precisão intermediária inclui a precisão diurna (datas de teste diferentes), a precisão da sala (condições ambientais diferentes: mudanças de temperatura e umidade, vibração, fluxo de ar, etc.), a precisão do pessoal (operadores diferentes), a precisão entre equipamentos (instrumentos diferentes ou lotes diferentes de instrumentos), a precisão entre lotes / dentro de lotes (amostras entre lotes ou dentro do mesmo lote), etc.
• Reproducibilidade (Reproducibilidade)A precisão dos resultados obtidos é medida por pessoas diferentes usando o mesmo método em laboratórios diferentes ou em ambientes diferentes. Na maioria dos casos, as autoridades reguladoras, como a FDA ou a EMA, geralmente não exigem a apresentação de dados de testes de reprodutividade, mas é necessário considerar tais testes nos seguintes casos: (a) métodos analíticos padronizados (por exemplo, para incluir um método de teste em uma farmacêutica). b) Utilização conjunta de vários laboratórios (por exemplo, quando os mesmos métodos são usados ​​por laboratórios interregionais ou interinstitucionais).

Na caracterização de nanopartículas, a precisão também é um dos indicadores essenciais para avaliar o desempenho do dispositivo. Os instrumentos de alta precisão são essenciais para garantir a confiabilidade dos dados experimentais. Por exemplo, a validação de precisão do tamanho das partículas geralmente avalia a precisão do instrumento medindo várias vezes a mesma amostra padrão do CRM, como uma microesfera padrão de nanopartículas rastreáveis, e calculando o desvio padrão (SD) ou o fator de variação (CV) dos resultados da medição.

Coeficiente de variação (CV)é um indicador estatístico para medir a discreção dos dados,Proporção do desvio padrão representado como dados em relação à média(Por isso, às vezes também chamado de desvio padrão relativo, RSD), é possível comparar intuitivamente a estabilidade de diferentes instrumentos ou diferentes condições de medição. É um indicador sem escala, geralmente expresso em porcentagens. Quanto menor o valor de CV, menor o grau de discreção, o que significa que a repetibilidade e a estabilidade dos resultados de medição são melhores e a precisão é maior. A fórmula para o cálculo do fator de variação é:

Onde σ é o desvio padrão (SD) e μm é a média dos dados de medição.

Alcance de Detecção (Range)

O âmbito de teste é o intervalo eficaz em que um método de análise pode ser aplicado à inspeção de amostras, garantindo que a precisão, a precisão e a linearidade estão em conformidade com os requisitos.

Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ)

• LOD:Os métodos ou instrumentos de análise podem detectar de forma confiável a presença de um objeto alvo (tamanho de partícula, concentração, potencial, etc.) sem exigir que o sinal seja quantificado com precisão. O LOD representa o limite inferior de sensibilidade do método de detecção e é essencial para a análise de traços.

• LOQ:O limite inferior do alcance de detecção do analítico pode ser medido quantitativamente. métodos ou instrumentos de análiseConfiável e precisoA medição dos valores do alvo (tamanho de partícula, concentração, potencial, etc.) requer precisão e precisão suficientes. Quando o LOQ é definido, é necessário atender a CV% ≤ 10% (ou requisitos mais rigorosos).

Artigos anteriores deste número detalham o significado e a importância dos limites de detecção no campo da caracterização de partículas no campo biofarmacêutico."As partículas caracterizam a face LOD"- É.

Intervalo de Linearidade (Linearity Range)

Linearidade refere-se à capacidade do método de análise de apresentar uma relação linear entre o sinal de detecção (valor de resposta) e a concentração ou quantidade da substância a ser testada dentro de um intervalo de concentração específico.Em suma, quando a concentração da amostra ou o número de partículas mudam dentro de um determinado intervalo, os resultados da medição devem variar proporcionalmente. Um bom método linear tem um coeficiente de correlação linear elevado (coeficiente de correlação R).²) e R²Quanto mais perto de 1, melhor a relação linear. Geralmente um conjunto de dados R²≥ 0,8 é considerado relevante; Para garantir a confiabilidade dos dados, muitas vezes é necessário R²≥ 0,99 (ou referência a padrões específicos da indústria).

Intervalo de linearidade (L)inearO REgionRefere-se à faixa máxima em que o método de detecção mantém uma relação linear dentro de uma determinada concentração ou número de partículas.Abaixo do limite inferior do intervalo linear, o sinal pode ser inferior ao LOD do instrumento e não pode ser detectado de forma confiável; Above o limite superior do intervalo linear, pode haver saturação do sinal, o instrumento não responder corretamente ou efeitos não lineares. Durante o processo de PQ, também é necessário validar o intervalo linear do método de análise ou do instrumento, geralmente usando os seguintes métodos experimentais:

• Método de Curva de Calibração (Calibration Curve Method)：Medir com amostras padrão de diferentes concentrações ou diferentes quantidades de partículas, desenhando curvas padrão. As etapas experimentais específicas são as seguintes:

1. Prepare uma série de amostras padrão em diferentes concentrações, que podem ser microesferas padrão com concentrações nominais teóricas ou outras amostras reais com concentrações conhecidas. Diferentes configurações de concentração são geralmente preparadas por diluição contínua ou multiplicada da amostra inicial. (O ICH recomenda a distribuição adequada de pelo menos cinco concentrações em toda a gama)^[2].)

2. Medir cada amostra separadamente usando o método a ser testado, registrando sinais de detecção (por exemplo, absorção, intensidade de fluorescência, área de pico, etc.) ou valores medidos (atribuição direta de concentração, etc.).

3. Desenha um gráfico de dispersão do sinal de detecção/valor (y) e da concentração esperada (x).

4. Calcule a inclinação (k), a separação (b) e os coeficientes de correlação (R) para ajustar a linha reta através da análise de regressão linear²).

5. De acordoO R²E os critérios de validação da taxa de recuperação (geralmente requerem desvios dentro de ± 10%) determinam intervalos lineares.

• Método de Regressão Linear (Linear Regression Method)：Se a concentração da amostra for desconhecida,Em seguida, com a concentração de líquido original da amostra como a concentração máxima, o mesmo sistema de líquido tampão é diluído contínuamente (ou diluído a partir do líquido original) 4-5 gradientes de concentração, implementando o método de curva padrão acima.A diferença é ajustar a concentração esperada para o inverso do múltiplo de diluição da amostra em cada gradiente de concentração (fator de diluição 1/N).Traça e avalie uma linha linear de ajuste de regressão entre a medição de concentração (ou média de concentração em cada ponto do gradiente) e a relação de diluição correspondenteO R²(como na imagem abaixo).Este método é um dos métodos mais utilizados na validação analítica.

Concentração linear de mistura de amostras de microesferas padrão NIST

• Método de Recuperação (Spiked Recovery Method)semelhante à verificação de precisãoExperimento de marcação,As etapas de análise são as seguintes:

1. Adicione um analítico alvo de concentração conhecida à matriz em branco para preparar uma série de amostras marcadas.

2. Medir amostras marcadas usando métodos a serem testados, registrar sinais de detecção ou valores diretos para calcular a taxa de recuperação.

3. Determinação de intervalos lineares com base na taxa de recuperação (geralmente 80%-120%) e nos resultados da análise de regressão linear^[6]- É.

Vale ressaltar queDistância entre o intervalo linear e o intervalo de detecção：

Por exemplo, um instrumento pode detectar uma concentração de 10⁶-10⁹particles/mL de nanopartículas (faixa de detecção), mas apenas em 2 x 10⁸-8×10⁸ Mantenha-se uma relação estritamente linear entre partículas/mL (intervalo linear). O intervalo linear geralmente começa com o LOQ e termina com a maior concentração ou tamanho de partícula em que a resposta do instrumento não apresenta mais uma relação linear. Em aplicações práticas, limites de detecção e intervalos lineares determinam juntos o escopo de medição e a aplicabilidade do dispositivo de análise de nanopartículas. Os limites de detecção mais baixos e os intervalos lineares mais amplos significam que o instrumento pode fornecer resultados de medição confiáveis em uma gama mais ampla de concentrações e tamanhos de partículas.

propriedade (Especificação/Seletividade)

Exclusividade: se o método de análise evita interferências de outras substâncias ao determinar o alvo, permitindo que o alvo seja identificado ou quantificado com precisão.A validação de propriedade é muitas vezes uma das primeiras considerações na validação de métodos analíticos, que se refere à escolha do método de teste aplicável. Validação de robustez de caracterização de nanopartículas é frequentemente adotadaExperimento de marcaçãoMétodos para realizar o teste de interferência:

1. Incorporar uma quantidade de amostras ou impurezas que não sejam sensíveis ao método atual na matriz da amostra a ser testada, como amostras que não sejam aplicáveis ao método de teste ou amostras de interferência que estejam fora do âmbito de teste. Verifique se a incorporação afeta os resultados do teste comparando as mudanças nos dados antes e depois da amostra de interferência. Por exemplo, um dispositivo de detecção com uma escala de 50-200 nm adiciona uma solução padrão de partículas de microesferas ou proteínas de tamanho menor conhecido (20-30 nm) à amostra a ser testada para determinar se o dispositivo é adequado para a caracterização de tais amostras, testando o tamanho e a concentração de partículas em amostras que contêm aditivos e em amostras que não contêm aditivos, respectivamente.

2. Adicionando o valor interno da quantidade conhecida à amostra a ser testada, avalie se a resposta de teste do equipamento à substância padrão está em conformidade com as expectativas teóricas e verifique se a medição da distribuição após a mistura de partículas de diferentes tamanhos é precisa. Por exemplo, a adição de uma quantidade equivalente (a mesma concentração de partículas) de um endossoma de microesferas de CRM de 150 nm em amostras de exossomas (normalmente na faixa de tamanho de partículas de 30-150 nm) detecta mudanças no tamanho e concentração de partículas da amostra após a adição do endossoma e antes da adição. Se o sinal interno correspondente for detectado e o valor médio do tamanho das partículas da mistura após a adição coincide com o tamanho médio teórico (a taxa de recuperação está dentro da faixa de aceitação) e os valores de concentração permanecem inalterados, o método de detecção pode ser considerado exclusivo para a amostra de exossoma. Este experimento é especialmente adequado para avaliar a capacidade do instrumento de detecção de amostras de sistemas polidispersos.

Além disso, experimentos exclusivos também podem ser comparados usando métodos ortogonais (outro princípio de medição diferente, mas totalmente comprovado). Ao mesmo tempo, se os princípios da própria técnica analítica assegurarem alta especificidade, não é necessária validação experimental adicional, mas apenas apoio teórico razoável.^[2]- É.

Robilidade(Robustão)

Robilidade(também conhecido como durabilidade)Refere-se a métodos analíticos para experimentar mudanças em condições em pequena escala(temperatura, pH, concentração de reagente, etc.)Mantenha a estabilidade e a confiabilidade dos resultados- É.Ele mede a tolerância do método a pequenas flutuações ambientais. Além disso, os testes de robustez também podem ser usados ​​para avaliar a estabilidade da preparação de amostras e reagentes, garantindo que os dados não sejam afetados por mudanças nesses fatores ao longo do experimento. Em termos gerais, é a avaliação antecipada da "capacidade anti-interferência" do método de teste para garantir que ele funcione corretamente em condições experimentais reais (não ideais). Os resultados dos testes de robustez podem ser apresentados como dados de referência durante a fase de desenvolvimento do método ou quando solicitado por uma autoridade reguladora.

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Conclusão

Estes parâmetros e experimentos analisados abaixo envolvem não apenas a adaptabilidade do instrumento em diferentes condições da amostra, mas também indicadores fundamentais como a precisão, repetibilidade e estabilidade a longo prazo dos dados. Somente essas validações rigorosas garantem que os instrumentos forneçam garantias de medição padronizadas e suporte de dados confiáveis ​​em ambientes de pesquisa e produção reais, e fornecem uma base científica para que os pesquisadores interpretem corretamente os resultados dos testes.

Referências:

Direção Geral de Supervisão do Mercado Nacional. (2020). Código de Gestão da Qualidade da Produção de Medicamentos (GMP).

Conselho Internacional para a Harmonização dos Requisitos Técnicos dos Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH). (2023). Validação dos procedimentos analíticos Q2(R2).

Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA (FDA). (2011). Validação de processos: princípios e práticas gerais.

Conselho Internacional para a Harmonização dos Requisitos Técnicos dos Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH). ICH Q7: Guia de Boas Práticas de Fabricação para Ingredientes Farmacêuticos Ativos. 2016.

5.USP Capítulo Geral <1058>: Qualificação do Instrumento Analítico[S]. Farmacópia dos Estados Unidos, 2023.

Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA (FDA). Guia de validação de métodos bioanalíticos para a indústria [S]. 2018.

Farmacêutica Chinesa Edição 2020 - Princípios Orientadores para a Validação de Métodos Analíticos 9101