Os sintetizadores de ácidos nucleicos são equipamentos essenciais para a biologia molecular moderna, a genômica e o desenvolvimento biomédico, que são capazes de sintetizar sequências específicas de DNA ou oligonucleótidos de RNA (oligonucleótidos) de forma eficiente e precisa in vitro.Seus princípios tecnológicos combinam a tecnologia de síntese em fase sólida, química orgânica e controle de automação de precisão, permitindo a "escrita sob demanda" do código genético da vida.

　　I. Princípio básico: química do fosfato de fase sólida

As principais tecnologias de síntese de ácidos nucleicos são baseadas no princípio da síntese de fase sólida, com o núcleo da química do fosfato de subamina. Com eficiência, alta produtividade e facilidade de automatização, este método substitui os métodos anteriores de fosfato diéster e fosfato triéster. Todo o processo de síntese é realizado dentro da coluna de síntese do instrumento e a direção de síntese da cadeia alvo é da extremidade 3 'para a extremidade 5'.

Um ciclo de síntese consiste principalmente em quatro etapas básicas:

1) Desproteção:

A síntese começa com a ligação covalente do primeiro nucleótido no veículo de fase sólida. O 5'-hidroxilo do nucleótido é fechado pelo grupo protetor. O primeiro passo do ciclo é lavar a coluna sintética com uma solução ácida, remover o protetor DMT da extremidade 5' do primeiro nucleótido, expor o 5'-hidroxi ativo e preparar-se para a reação de acoplamento seguinte. O catião DMT removido é laranja e a eficiência da síntese pode ser monitorada on-line por fotometria.

Ativação e ligação:

Em seguida, o instrumento bombeia simultaneamente o próximo monómero nucleotídico e o ativador para a coluna de síntese. O monómero nucleotídico em si é altamente ativado, com a extremidade 3' protegida pelo subgrupo fosfato e a extremidade 5' protegida pelo DMT, com protetores correspondentes na base.

O ativador ativa o subgrupo fosfato 3' do monómero nucleótido, tornando-o um bom reagente eletrófilo. Em seguida, ele reagiu rapidamente com a substituição nucleófila do 5'-hidroxilo exposto no veículo de fase sólida, formando ligações triéster fosfato, adicionando novos nucleótidos à cadeia de oligonucleótidos estendida.

3. chapéu:

As etapas de acoplamento não são 100% eficazes e há sempre uma pequena quantidade de cadeias de 5'-hidroxi que não participam da reação. Essas sequências falhadas, se não forem fechadas, continuarão envolvidas na reação durante o ciclo de seguimento, gerando subprodutos da sequência ausente.

A etapa de "tampa" usa uma mistura de dois reagentes para acetilar o 5'-hidroxi não reagido para desativá-lo permanentemente. Essas cadeias curtas "cobertas" são removidas durante a purificação final, melhorando significativamente a precisão e pureza da sequência do produto final.

4. Oxidação:

A ligação anterior é formada por ligações fosfato-triéster instáveis que são facilmente decompostas pelo ácido. Esta etapa conduz à mistura de iodo/água/piridina, oxidando-a em ligações fosfato-triéster mais estáveis, completando um ciclo completo de adição de nucleótidos.

Depois disso, o instrumento repete automaticamente as quatro etapas de "desprotecção → acoplamento → tampa → oxidação" acima, adicionando um novo nucleótido a cada ciclo até que toda a sequência alvo seja totalmente sintetizada.

　　Tratamento pós-síntese

Após a montagem da cadeia do sintetizador de ácidos nucleicos, o produto resultante permanece como um produto bruto de DNA ligado a um veículo de fase sólida e todos os grupos protegidos. Portanto, é necessário um tratamento posterior:

Corte e desprotecção: o tratamento com solução de amônica concentrada corta a cadeia de oligonucleótidos sintéticos do veículo CPG, por um lado, e elimina sincronicamente os grupos protetores em todas as bases e os grupos DMT no extremo da cadeia, por outro lado.

Purificação: de acordo com as necessidades da aplicação, a purificação pode ser feita por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), para remover sequências de falhas e subprodutos, obtendo um produto final de alta pureza.

　　III. Resumo

A essência do sintetizador de ácidos nucleicos é um reator químico orgânico de precisão altamente automatizado. Ele permite a síntese rápida, de alto fluxo e precisa de oligonucleótidos de DNA/RNA ao decompor reações químicas sintéticas complexas em uma série de etapas padronizadas e controladas por programação e controlar com precisão a velocidade de fluxo do líquido, a dose de reagente e o tempo de reação por computador. A maturidade e a popularidade desta tecnologia impulsionaram enormemente o rápido desenvolvimento de tecnologias de ponta como edição genética, teste PCR, medicamentos com ácidos nucleicos e armazenamento de DNA.