Anatomia do microscópio fluorescente Olympus

26/07/2018 07:52:45 Publicado por admin

com outras características baseadas em amostras macroMicroscópio ópticoEm comparação com padrões, como gradientes de fase, absorção de luz e dupla refração, o microscópio de fluorescência é capaz de imagem da distribuição de tipos de moléculas individuais com base apenas nas propriedades da emissão de fluorescência. Portanto, com o uso de microscópio fluorescente, é possível monitorar a localização exata dos componentes intracelulares marcados com um fluoróforo específico, bem como seus coeficientes de difusão associados, características de transporte e relação com outros.Biologiainteração das moléculas. Além disso, a resposta significativa da fluorescência a variáveis ambientais locais permite estudar o pH, a viscosidade, a taxa de refração, a concentração de íons, o potencial da membrana e a polaridade do solvente em células e tecidos vivos.

As primeiras configurações de microscópio fluorescente utilizam transmissão de campo claro ou campo escuro clássico (Luz transmitida）Sistema ópticoA luz excitada através do filtro é focada no plano da amostra. A emissão de fluorescência é coletada através do objetivo, bem como uma grande quantidade de exposição estimulada, e projetada no apêndice do óculo através de um segundo filtro para formar uma imagem intermediária. Como a intensidade da luz estimulada é geralmente várias ordens de quantidade maior do que a emissão de fluorescência, as visões de amostras nesses microscópios de luz de transmissão iniciais geralmente têm um contraste muito baixo e são sobrepostas sobre um fundo cheio de irradiação estimulada dispersa. O uso de um focador de campo escuro submerso em óleo de abertura numérica elevada para irradiar a amostra com um ângulo de inclinação elevada ajuda a eliminar a maior parte do ruído de fundo, mas não fornece iluminação suficiente, exceto para objetivos de abertura numérica baixa. A imagem produzida é de má resolução e brilho muito baixo.

Microscópio fluorescente e luz de entrada (Luz refletidaA iluminação foi desenvolvida pela primeira vez no final da década de 1920 para observar a emissão de fluorescência em amostras metalúrgicas opacas. Assim como seus homólogos de campo claro, esses instrumentos de fotofluorescência refletida usam um divisor semireflexivo com uma eficiência total de cerca de 25% (perda de 50% de iluminação após cada passagem pelo espelho). No entanto, o microscópio fotofluorescente refletido goza da vantagem de ter objetos de alto valor de abertura como focadores e é capaz de produzir imagens com níveis significativamente mais elevados do que os microscópios de luz transmissível que operam com aberturas numéricas semelhantes. Além disso, a luz de excitação dispersa do retroscópio refletido (em aberturas numéricas elevadas) é reduzida a apenas alguns percentuais. O duplo papel dos objetos no microscópio de luz refletida também simplifica significativamente a tarefa de alinhamento. Focar apenas o objetivo na amostra estabelece campos de iluminação e de visão, permitindo que a luz estimulada entrante e a emissão fluorescente observada sigam o mesmo caminho através da série óptica do microscópio.

Quando as lâmpadas compactas de descarga de vapor de mercúrio e arco de xenão foram desenvolvidas em meados da década de 1930, os avanços tecnológicos nas fontes de iluminação impulsionaram a transformação da fotofluorescência refletida (pelo menos para a metalurgia). Durante este período, os filtros de vidro colorido e gelatina também se tornaram mais complexos, o que permitiu aplicar tintores fluorescentes estimulados pela luz visível azul e verde usando lâmpadas de halotungstênio. Revestimentos anti-reflexo e fórmulas de vidro melhoradas levaram a melhorias significativas no design de objetivos na década de 1940, mas a contribuição fundamental para o desenvolvimento do microscópio fluorescente de luz de entrada foi a introdução do espectroscópio bicolor (também conhecido como espelho bicolor)) iniciado pelo cientista óptico russo Eugeny Brumberg em 1948. Esta inovação supera o problema de perda de luz inerente ao uso de espelhos semirrefletores comuns em microscópios de luz refletida. O microscópio de fluorescência refletida foi inicialmente amplamente comercializado no final da década de 1960 por Johan S. Ploem, que desempenhou um papel importante no desenvolvimento do Wild-Leitz Ploem Opak, que contém vários módulos ópticos intercambiáveis ​​e equipados com uma variedade de combinações de filtros de microscópio de fluorescência.

Estratégias básicas do microscópio fluorescente de queda

A grande maioria dos microscópios fotofluorescentes refletidos são métodos de escolha atual para estudos de campo amplo para fontes de luz não coerentes, bem como aqueles realizados com instrumentos confocais e multifotônicos de varredura a laser. Este padrão popular de microscópio de fluorescência também é conhecido como fluorescência de luz de entrada, fluorescência de reflexão ou fluorescência de queda simples. Os microscópios fotofluorescentes refletidos modernos típicos também são equipados com observações de luz transmissível em vários modos de aumento do contraste, como mostrado na Figura 1. O microscópio contém uma cabeça de observação trióptica, acoplada ao sistema de câmera do dispositivo de acoplamento de carga (CCD), com duas fontes de iluminação, uma para transmitir a luz e outra para observação (descarga de arco de tungstênio-halogênio e mercúrio, respectivamente). O microscópio é projetado para combinar ou alternar observações de fluorescência refletida com contraste de fase de luz transmissível, contraste de interferência diferencial (DIC), luz polarizada ou contraste modulado por Hoffman.

A característica básica de qualquer microscópio de fluorescência é fornecer um mecanismo para estimular a amostra, que tem iluminação filtrada seletivamente e, em seguida, usa um segundo filtro para separar a emissão de fluorescência mais fraca para formar imagens com grande sensibilidade em um fundo escuro. Em muitos experimentos, as concentrações locais da sonda em amostras biológicas são muito baixas e apenas uma pequena parte da luz excitada é absorvida pela substância fluorescente. Além disso, a porcentagem de fluorescência secundária emitida é ainda menor naqueles que são capazes de absorver uma certa quantidade de exposição. O nível de brilho de emissão de fluorescência obtido será de três a seis graus de magnitude mais baixo do que o nível de brilho da iluminação. Assim, o problema fundamental do microscópio de fluorescência é gerar iluminação eficiente para as amostras, ao mesmo tempo que captura a emissão de fluorescência fraca que é eficazmente separada com faixas de irradiação mais intensas. Essas condições são atendidas em instrumentos fluorescentes modernos através de uma combinação de filtros que coordenam os requisitos de excitação e emissão com base no papel e nas características do divisor bicolor.

A Figura 2 descreve o princípio por trás da função do divisor bicolor (espelho) no microscópio de fluorescência de reflexão, que contém uma amostra hipotética de um grupo de fluorescência que estimula e emite fluorescência de comprimento de onda vermelho (620 a 660 nm) na área verde (550 nm). Espectro visível. As fontes de luz de alta intensidade emitem uma ampla gama de comprimentos de onda de excitação com alta densidade de fluxo (geralmente cobrindo a maioria dos raios UV e todo o espectro visível), que atravessam o iluminador e encontram-se primeiro com o filtro que seleciona a banda de excitação apropriada (marcada como EF; veja Figura 2 (a)). Neste caso, o filtro passa a luz com alta eficiência em comprimentos de onda entre 510 e 560 nm, mas também permite que outros comprimentos de onda passem em graus menores. A luz excitada chega então ao espelho bicolor (DM na Figura 2) e é refletida no orificio traseiro do objetivo para formar uma iluminação conica da amostra irradiada. O espelho bicolor está localizado no caminho da luz, com um ângulo de 45 graus, e foi projetado para refletir seletivamente comprimentos de onda entre 490 e 565 nm (como mostrado na Figura 3), enquanto transmite comprimentos de onda mais curtos e mais longos.

A Figura 3 mostra a curva de transmissão usada para combinar filtros que separam a luz excitada da emissão de fluorescência na Figura 2. O espectro do filtro de excitação (curva vermelha) mostrou altos níveis de transmissibilidade (cerca de 80%) entre 510 e 560 nm. Comprimento de onda central (CWL) 535 nm. Os espelhos bicolores (curvas amarelas) refletem comprimentos de onda na região do espectro, enquanto passam por comprimentos de onda mais e mais baixos com eficiência relativamente alta. Observe que a transmitência percentual na curva do espelho bicolor corresponde a 100% de reflexão. Uma diminuição significativa na distribuição de transmissão entre 490 e 570 nm (que representa o pico da refletidão) foi usada para refletir a faixa de comprimento de onda do filtro de excitação para a amostra em um ângulo de 90 graus. O último componente da série óptica, o filtro de emissão ou barreira (curva branca), transmite comprimentos de onda superiores a 590 nm, o que corresponde a luz visível com amarelo, laranja e vermelho. As fronteiras entre as bandas de transmissão e reflexão de vários espectros de superposição são projetadas para ser o mais íngreme possível para garantir que os comprimentos de onda de reflexão e transmissão sejam quase * separados. O padrão de picos sinusois ascendentes e descendentes que aparecem no espectro bicolor é um efeito comum do processo de deposição de película fina, chamado de sonoro contínuo. O excelente desempenho desta combinação de filtros demonstra claramente o rápido desenvolvimento da tecnologia de filtros de interferência de película fina.

Como apenas a luz de largura de banda estreita é refletida pelos espelhos bicolores, os comprimentos de onda de irradiação mais curtos de 490 nm e mais longos de 565 nm também são transmitidos através dos espelhos bicolores por excitação do filtro, como mostra a luz acima do corte. Na Figura 2 (a). Observe que a reflexão da luz excitada não é 100% eficaz e, portanto, uma pequena quantidade de luz verde passa pelo espelho bicolor sem ser refletida. Além disso, nem toda a luz com comprimento de onda maior que 565 ou menor que 490 nanômetros passa pelo espelho. Uma pequena parte dessa luz é refletida pela amostra através do espelho.

A emissão fluorescente da amostra gerada pela excitação de luz verde (principalmente comprimentos de onda vermelhos) é agrupada pela lente e atravessada pelo espelho bicolor e filtro de barreira (acima da luz cortada na Figura 2 (c)). Os filtros de barreira (marcados como BF na Figura 2) foram projetados especificamente para permitir que apenas a luz com comprimentos de onda maiores que 590 nanômetros alcance os óculos do microscópio e / ou detectores. Quando usado para esta tarefa, o filtro de barreira impede eficazmente que o comprimento de onda de luz excitada da amostra refletida (e com sucesso através do espelho bicolor) chegue ao detector. No entanto, a maioria dos comprimentos de onda de excitação retornados da amostra é refletida pelo espelho bicolor (luz abaixo da luz de corte na Figura 2 (c)) para o filtro de excitação e emissor de luz. O efeito líquido da configuração do filtro mostrada nas Figuras 2 e 3 é separar a luz excitada de intensidade significativamente maior da emissão de fluorescência mais fraca. Em todos os casos, como mostrado na figura, o nível de corte do filtro envolvido no microscópio fluorescente não é, mas pode permitir que alguma luz penetre fora da faixa de comprimentos de onda. Toda a sequência de eventos é mostrada gráficamente na Figura 2 (b), que ilustra o caminho óptico e a disposição estratégica do filtro necessários para um microscópio fotofluorescente de reflexão eficaz.

Iluminação fluorescente vertical

O núcleo do microscópio fluorescente moderno é o iluminador vertical de luz refletida universal, que é inserido no tubo de observação da observação e do objeto transportador.Objetivosentre os conversores, como mostrado nas Figuras 1 e 4. O iluminador é projetado para orientar a luz gerada pela luz alta - colocando a fonte de intensidade sobre a amostra, primeiro fazendo a luz passar pelo objetivo do microscópio na direção da amostra e, em seguida, capturando a luz emitida pela amostra usando o mesmo objetivo. Este tipo de estratégia de iluminação tem várias vantagens. O objetivo do microscópio funciona primeiro como um focador bem corrigido e, em seguida, coleta a emissão de fluorescência de imagem para ser transmitida para o sistema de detecção de óculos ou câmeras. Portanto, o objetivo está sempre alinhado corretamente em relação a cada função. Além disso, a maior parte da luz estimulada dispersa ou refletida pela amostra (em ângulo de 360 graus) fica longe dos componentes da lente frontal do objetivo, em vez de ser projetada diretamente no vidro, como no caso da radiação fluorescente transmitida. Este efeito é conhecido como iluminação frontal e é especialmente adequado para espécimes grossas. Depois, a área da espécime exposta é limitada à mesma área observada, e tanto a iluminação quanto a coleta de luz podem aproveitar a abertura total do objeto.

Na extremidade distante do iluminador vertical está uma caixa de luz (ver Figura 4), que contém uma descarga de arco de alta intensidade ou uma fonte de luz incandescente baseada em seda. Fontes populares de iluminação são lâmpadas de arco de mercúrio de alta pressão de 100 watts (HBO, geralmente conhecido como queimador), no entanto, lâmpadas de arco de xenônio e halogeno metálico, lasers e lâmpadas incandescentes de halogeno de tungstênio também podem ser usadas para este propósito. A luz emitida pela fonte de luz é focada pelo sistema de lentes de foco e viaja ao longo do interior do iluminador paralelo à área de trabalho e vertical ao eixo óptico do microscópio. O projeto do emissor de luz mostrado na Figura 4 inclui um sistema de lentes de coletor multicomponente, mas também implementa componentes de lentes não esféricas para melhorar a correção da diferença de cor nas áreas de infravermelho próximo e ultravioleta. Os filtros térmicos projetados para remover ou suprimir comprimentos de onda infravermelhos são colocados no interior da própria caixa de luz ou perto da parte traseira do iluminador vertical. Além disso, alguns microscópios contêm sistemas próximos a caixas de luz de balanceamento de estimulação de duas ou várias frequências (ver Figuras 4 e 8) que filtram seletivamente comprimentos de onda indesejados de estimulação para ajustar o desempenho do conjunto de filtros fluorescentes contidos no outro extremo do iluminador.

Também localizado perto da caixa de luz no iluminador vertical é um conjunto de filtros de densidade neutra que podem ser usados ​​para regular a intensidade total da luz que passa pelo sistema e reduzir o desvanecimento fluorescente ou branqueamento de luz. Estes filtros são geralmente instalados em uma estrutura deslizante, permitindo-lhes inserir rapidamente o caminho de luz e removê-lo do caminho de luz enquanto observam a fluorescência da amostra. Para estabelecer a iluminação Köhler, o iluminador vertical contém uma combinação de abertura habitável e apendice de campo de visão, ambos com abertura variável que determina o tamanho do campo e a intensidade da iluminação. O ajuste do par de abertura e apendice de campo, bem como o tamanho da abertura, é possível através de vários pares de botões localizados em cada lado externo da caixa de iluminação vertical. Em alguns projetos, um botão deslizante é fornecido para remover todo o componente de abertura do caminho de luz para maximizar a quantidade de luz que passa pelo iluminador. Outros microscópios contêm um orifício de agulha de tamanho fixo, montado em um deslizante, que pode ser inserido em um caminho de luz que limita significativamente o campo de iluminação e é adequado para aplicações especiais, como a recuperação de fluorescência após branqueamento de luz (FRAP).

Após o apendice de campo e o apendice de campo na série óptica de iluminadores verticais está a lente de campo, que é necessária para difundir a luz e gerar campos de iluminação suficientes para estabelecer a iluminação Kohler. Depois do espelho de campo, todos os iluminadores verticais modernos contêm uma barra de luz (com controle de interruptor manual) que impede que a luz intensamente excitada chegue ao conjunto de filtros e às amostras quando a fluorescência não é observada ou gravada. O obturador é uma característica fundamental do microscópio fluorescente, porque a exposição contínua à amostra pode reduzir significativamente a emissão devido ao branqueamento de luz, enquanto a luz de alta intensidade é insalubre para as células vivas. Além disso, o obturador mantém a lâmpada de descarga de arco ativa (reduzindo o tempo de pré-aquecimento), enquanto a amostra é inspecionada instantaneamente com a luz transmitida. Os microscópios fluorescentes são geralmente equipados com obturadores eletrônicos para controlar rapidamente a iluminação remotamente. O protetor contra os raios ultravioletas (o protetor respiratório marcado na Figura 4 é instalado na parte frontal da carcaça do iluminador para proteger o operador contra vazamentos acidentais de radiação ultravioleta de onda curta potencialmente perigosa quando o obturador está aberto. O protetor desempenha um papel duplo, protegendo a amostra dos gases de expiração durante a observação.

Vários projetos de iluminação vertical oferecem ranuras para estruturas de polarizadores retangulares, que podem ser usadas para pesquisas de polarização fluorescente. Na maioria dos casos, o polarizador é inserido no caminho de iluminação atrás do espelho de campo (longe do plano conjugado), mas antes da porta de luz (ver Figura 4). Os polarizadores podem ser fixados no local com uma direção de transmissão pré-determinada ou montados em um conjunto de engrenagens, permitindo que a direção do eixo de transmissão seja alterada usando a roda dedal. Como o polarizador é instalado em uma estrutura deslizante, ele pode ser facilmente removido do caminho óptico quando não é usado. O analisador fornecido (o segundo polarizador necessário para medições de heterossexualidade de fluorescência) pode ser instalado em uma iluminação vertical acima da torre rotativa do bloco de filtro ou em um tubo intermediário de microscópio polarizador especialmente projetado. Os tubos auxiliares são geralmente capazes de inserir unidades polarizadoras rotativas em gradiente para garantir o posicionamento preciso da direção de transmissão do analisador em relação ao polarizador e ao eixo óptico do microscópio.

O nível posterior da iluminação vertical contém uma mesa giratória ou suporte deslizante com um bloco óptico que contém uma combinação de filtros fluorescentes. Quando é necessário combinar imagens com filtros fluorescentes específicos, o bloco de filtro gira (ou desliza) para a série óptica. Os blocos individuais contêm um conjunto combinado de filtros de excitação e emissão, bem como espectroscópios bicolores, todos cuidadosamente posicionados para maximizar a exposição da amostra e capturar a emissão fluorescente de comprimentos de onda específicos. A torre rotativa de blocos ópticos e o suporte deslizante podem carregar de três a seis blocos separados, um dos quais está localizado no caminho óptico, enquanto os outros estão girando ou deslizando no armazenamento temporário. Ao observar amostras marcadas com duas ou mais sondas fluorescentes, esses anexos podem ser rapidamente convertidos entre grupos de filtros fluorescentes. O uso de iluminação transmissível em microscópios equipados com iluminadores fluorescentes é facilitado por blocos ópticos virtuais montados em ranhuras em mesas de viragem ou suportes deslizantes. O bloco virtual bloqueia a emissão de excitação (quando o obturador está aberto), mas não contém nenhum filtro e permite que a luz do objetivo passe sem obstáculos pelo tubo de observação.

No microscópio vertical modular padrão, a iluminação verticalMicroscópioEntre a estrutura e o tubo de observação (ver Figura 1). Muitos fabricantes oferecem tubos intermediários que podem ser inseridos entre o iluminador e a unidade de óculos para polarizadores, prismas DIC ou outros acessórios. Quadros de microscópio modernos são geralmente o resultado de esforços de design assistido por computador, que levam a uma diminuição significativa da vibração e características ergonômicas melhoradas. Os materiais sintéticos, como a cerâmica à base de metais e os compostos de alumínio, podem melhorar significativamente a rigidez estática e térmica da estrutura, permitindo que os instrumentos suportem os rigorosos requisitos de tecnologias de fluorescência avançadas que exigem a eliminação de vibrações por um longo período de tempo * para a emissão de fluorescência fraca de imagem.

Iluminação do microscópio fluorescente Köhler

Em iluminadores verticais fluorescentes, a fonte de luz é posicionada de modo a que a esfera de plasma de descarga de fio fino ou arco esteja perto do foco principal da lente de foco. Na iluminação Köhler, as lentes de foco desempenham o papel de uma fonte de luz auxiliar significativamente aumentada para melhorar a iluminação geral. Uma das principais exigências da iluminação Köhler é que a imagem de um fio ou arco de lâmpada deve ser projetada no plano focal posterior da lente, que também é o dobro do foco (geralmente com uma abertura numérica elevada) durante a excitação da exposição à luz refletida. Idealmente, a fonte de luz deve preencher toda a abertura da lente para maximizar a intensidade da radiação e gerar um campo uniformemente irradiado. Em alguns casos, ponto quente). No entanto, como os filtros de difusão também reduzem a iluminação, o uso deve ser evitado sempre que possível.

Na iluminação Köhler com luz refletida (ilustrada ilustrativamente na Figura 5), a imagem da fonte de luz é focada por uma lente de foco em uma membrana de apendice de abertura localizada no iluminador vertical. O apêndice compartilha o plano conjugado com o orificio traseiro da lente e o arco ou fio, determinando assim o tamanho do orificio do campo a ser irradiado. A fonte de luz, o apendice de luz do abertura do iluminador vertical e o plano retrofocal da lente (pupila de luz) juntamente formam um grupo de iluminação do plano conjugado. Ao contrário do microscópio de luz de transmissão, a abertura e a fonte de luz são imagens no plano de abertura posterior da lente (que atua como um focador), em vez de estar fisicamente localizados nessa posição. Como um benefício adicional desta configuração, todos os obstáculos, como a abertura do íris, são removidos do caminho da luz quando o objetivo fornece uma exposição estimulada ou uma imagem formada por uma emissão de fluorescência agregada. Ativar ou desligar o apendice de abertura é usado para controlar a luz dispersa e ajustar a intensidade da iluminação (abertura numérica) sem alterar o tamanho do campo de iluminação. Na imagem, o ajuste do apendice de abertura afeta o brilho e o contraste.

A imagem de um plano conjugado ou grupo de campo na iluminação de Köhler refletida é composta por um apendice de campo de luz, uma superfície de amostra e um plano de imagem intermediário. Assim, quando o apendice de campo é focado no plano da amostra, a imagem da fonte de luz é removida significativamente do foco para fornecer um campo de iluminação uniforme. O apendice do campo de visão controla o tamanho do campo de exposição sem afetar a intensidade da iluminação da área observada. Na prática, o tamanho da abertura do apendice de campo de luz deve ser o mais pequeno possível para aumentar o contraste da imagem e reduzir o grau de branqueamento de luz em áreas não observadas diretamente. Embora a maioria das descargas de arco e fontes de luz de filamento produzam intensidade de iluminação desigual, a iluminação Köhler irradia uniformemente o campo da amostra. Após a configuração correta do microscópio, o plano de foco posterior* da lente ilumina, proporcionando uma área uniformemente brilhante da borda à borda. Idealmente, a iluminação Köhler banha a amostra com um conjunto de fronts de onda reunidos, cada um formado por pontos separados na fonte de luz que são imagenados no abertura do focador. No microscópio fluorescente corretamente configurado, o resultado é o contraste e a resolução da imagem. Idealmente, as amostras são banhadas com um conjunto de fronts de onda reunidas, cada um gerado a partir de diferentes pontos na fonte de luz da imagem para o diámetro do focador. No microscópio fluorescente corretamente configurado, o resultado é o contraste e a resolução da imagem. Idealmente, as amostras são banhadas com um conjunto de pré-ondas reunidas, cada pré-onda a partir da imagem paraEspelho de FocoOs diferentes pontos de abertura da fonte de luz são gerados. No microscópio fluorescente corretamente configurado, o resultado é o contraste e a resolução da imagem.

Fontes de luz e faroles

Para uma análise quantitativa rigorosa no microscópio fluorescente, a exposição da amostra deve ser constante no tempo e no espaço em todo o campo de visão. A instabilidade ao longo do tempo geralmente reflete a flutuação da radiação da luz devido a mudanças na saída de energia. Em vez disso, a perturbação espacial comum na luz de arco vem de um fenômeno chamado de piscar porque as esferas de plasma se movem de frente para trás sobre os eletrodos. O piscar é geralmente gerado por flutuações de energia, pequenas mudanças na resistência do eletrodo ou vibrações mecânicas. Fontes de luz baseadas em fios, como as populares lâmpadas halogenadas de tungstênio, são muito estáveis ​​ao trabalhar em corrente contínua constante usando uma fonte de energia de tensão regulada. Normalmente, a fonte de luz deve ser selecionada por seu conteúdo espectral, tamanho do fio em comparação com a área de abertura posterior do objetivo, estabilidade espacial e temporal e uniformidade da iluminação de campo. Também é necessário prestar especial atenção à intensidade da fonte de luz, porque o comprimento de onda de banda estreita através do filtro de excitação inclui apenas uma pequena parte da saída total do emissor de luz.

As principais considerações na escolha de fontes de luz para microscópios fluorescentes são relacionadas com o estudoColorantes fluorescentesA distribuição do espectro ultravioleta e visível associada à produtividade quântica e absorção. Além disso, a fonte de luz deve ser compatível com a sensibilidade do detector usado para capturar a imagem, seja olho humano, filme convencional, tubo fotomultiplicador, tubo de vídeo aprimorado ou sistema de câmera digital. A escolha também depende do modo de iluminação. O uso de descarga de arco ou fontes de tungstênio-halogênio para atender aos requisitos de microscópio de fluorescência de campo amplo, enquanto o microscópio cofocal e multifotônico precisa se adaptar a uma variedade de sistemas laser. O uso de lâmpadas incandescentes de tungstênio e tungstênio-halogênio teve um sucesso limitado, porque a maior parte de suas emissões ocorrem nas áreas vermelhas e infravermelhas do espectro, enquanto a maioria dos fluoróforos é estimulada por comprimentos de onda ultravioleta, azul e verde. Além disso, a saída de luz da lâmpada de descarga de arco é 10 a 100 vezes mais brilhante do que a lâmpada de halogênio de quartzo de 12 volts normalmente usada para transmitir a luz. A fonte de luz popular para o microscópio fluorescente de campo amplo é a lâmpada de arco de mercúrio, que geralmente é incluída na configuração básica do microscópio modelo. Lámpadas de arco de xenão e halogenos metálicos são usadas em alguns casos, mas estas geralmente são limitadas a casos especiais em que a distribuição espectral e de intensidade correspondem aos requisitos específicos do fluoróforo.

O design das lâmpadas de mercúrio e xenão é semelhante, exceto o tamanho físico e o gás na caixa da lâmpada. A lâmpada de mercúrio contém dois eletrodos selados em uma lâmpada de vidro de quartzo a alta tensão, que também contém o elemento mercúrio vaporizado. Quando a fonte de energia é ativada, uma série de pulsos de alta tensão é enviada para o eletrodo, ionizando uma pequena parte do gás mercúrio e acendendo a lâmpada. Após a queima, a tensão diminui e o gás ionizante é usado para transportar a corrente e gerar esferas de plasma formadas entre os dois eletrodos. Durante o trabalho da lâmpada, a evaporação de mercúrio produz grandes quantidades de calor e pressão dentro da lâmpada de vidro, resultando em uma luz de alta intensidade. A luz gerada pela lâmpada de arco de mercúrio é contínua, mesmo dentro do espectro ultravioleta e visível, concentrada em comprimentos de onda discretos de 365.400.440.546 e 580 nanômetros. De ultravioleta a infravermelho, as lâmpadas de xenão têm uma distribuição de intensidade mais uniforme em toda a gama espectral. A escolha de corantes fluorescentes é essencial para determinar a fonte de luz adequada para o microscópio fluorescente. Algumas sondas fluorescentes têm faixas de excitação que coincidem com linhas de mercúrio salientes, enquanto outras se beneficiam de uma distribuição mais uniforme da exposição à lâmpada de xenão.

O alinhamento correto das luzes de arco no microscópio fluorescente é essencial para alcançar a iluminação Kohler e evitar áreas claras e escuras na imagem fluorescente. Portanto, a qualidade da caixa de luz pode geralmente ser julgada pela estabilidade do alinhamento correto da luz e pela eficiência do botão de regulação usado para manter o alinhamento. O suporte de lâmpada deve ser equipado com um par de parafusos médios para que a imagem curva seja centrada no orifício traseiro do objetivo, e a caixa de lâmpada deve conter um filtro de infravermelho para bloquear comprimentos de onda longos no vermelho distante e infravermelho, gerando assim uma grande quantidade de calor. Algumas caixas de luz são projetadas com um filtro de supressão de vermelho incorporado (por exemplo, Schott BG38), ou uma ranura para tal filtro para eliminar o fundo vermelho visto através do campo de visão em algumas aplicações. Além disso, a caixa de luz em si não deve vazar comprimentos de onda UV prejudiciais e, de preferência, um interruptor para desligar automaticamente a luz deve ser incluído se a caixa for aberta involuntariamente durante a operação. Depois, a caixa de luz deve ser robusta o suficiente para suportar possíveis explosões do queimador durante a operação.

A ampla variedade de aplicações de microscópio de fluorescência geralmente requer uma variedade de fontes de luz para atender às exigências específicas de fluorescência e condições de imagem. Em alguns casos, uma combinação com um sistema de câmera ultra-sensível pode exigir uma radiação muito baixa, enquanto que para outros estudos, uma forte estimulação laser pode ser necessária para matar células vivas ou branquear seletivamente o fluorescente. Os comprimentos de onda requeridos geralmente abrangem toda a área visível do espectro, bem como partes de raios ultravioleta e infravermelho. Como uma única fonte de luz não pode atender a esses múltiplos requisitos de iluminação, os adaptadores que os fabricantes oferecem agora podem conectar duas ou mais lâmpadas simultaneamente a um único microscópio.

Combinação de filtros fluorescentes

Como mencionado anteriormente, a lente e a luz que atravessam o iluminador vertical encontram filtros de excitação alojados no bloco óptico, que é posicionado para coincidir com o ponto de cruzamento axial entre o caminho óptico do iluminador e o sistema óptico do microscópio. O filtro de excitação seleciona um comprimento de onda de banda estreita do espectro amplo gerado pela luz e os transmite para o espelho bicolor, que, por sua vez, reflete a luz através do objetivo e irradia a amostra. Antes de formar a imagem no apendice fixo do óculo, a emissão de fluorescência agrupada pelo objetivo passa novamente pelo espelho bicolor e o filtro de emissão ou barreira. Filtros comuns usados para separar bandas em microscópios de fluorescência de campo amplo incluem filtros de vidro colorido e filtros de película interferente (ou uma combinação de ambos). Determinar o filtro adequado para cada etapa do esquema de iluminação e imagem do microscópio fluorescente pode causar confusão, pois envolve um grande número de fabricantes de filtros, cada um dos quais fornece uma nomenclatura alfanumérica exclusiva para a literatura fluorescente.

A Figura 7 mostra o típicoBloco de excitação fluorescenteA anatomia, bem como os contornos espectrais associados dos espelhos bicolores, excitação e filtros de barreira. Os blocos de filtro são geralmente montados por ferramentas personalizadas fornecidas pelo fabricante, para que o operador possa trocar filtros e espelhos bicolores. Os filtros de excitação e barreira são fixados no lugar através de pinças fixas, colas ópticas ou suportes de montagem de rosca redonda (ver Figura 7). Normalmente, esses filtros podem ser removidos sem abrir o bloco óptico, pois estão localizados acima dos buracos recebidos em uma superfície externa plana. A substituição de espelhos bicolores é mais difícil e o bloco de desmontagem * é necessário para entrar no interior. A maioria das seções de bloco é fundida com juntas diagonais de 45 graus, o que permite uma dupla tarefa, protegendo o interior e apoiando o espelho bicolor no ângulo apropriado. Depois de remover o elemento de fixação (pino ou parafuso pequeno) que fixa a parte do bloco, o espelho pode ser removido soltando ou movendo o clipe de fixação e, em seguida, removendo-o cuidadosamente do bloco. Os espelhos bicolores devem ser tratados com cuidado, pois os revestimentos interferentes geralmente não são protegidos e são fáceis de arranhar. Vários fabricantes de filtros que fornecem empresas de microscópios também oferecem uma variedade de filtros pós-venda e espelhos bicolores para uma variedade de aplicações de fluorescência. Depois de remover o elemento de fixação (pino ou parafuso pequeno) que fixa a parte do bloco, o espelho pode ser removido soltando ou movendo o clipe de fixação e, em seguida, removendo-o cuidadosamente do bloco. Os espelhos bicolores devem ser tratados com cuidado, pois os revestimentos interferentes geralmente não são protegidos e são fáceis de arranhar. Vários fabricantes de filtros que fornecem empresas de microscópios também oferecem uma variedade de filtros pós-venda e espelhos bicolores para uma variedade de aplicações de fluorescência. Depois de remover o elemento de fixação (pino ou parafuso pequeno) que fixa a parte do bloco, o espelho pode ser removido soltando ou movendo o clipe de fixação e, em seguida, removendo-o cuidadosamente do bloco. Os espelhos bicolores devem ser tratados com cuidado, pois os revestimentos interferentes geralmente não são protegidos e são fáceis de arranhar. Vários fabricantes de filtros que fornecem empresas de microscópios também oferecem uma variedade de filtros pós-venda e espelhos bicolores para uma variedade de aplicações de fluorescência.

Os projetos de filtros fluorescentes incluem longa passagem, curta passagem (filtros de borda) e linhas de filtros de banda estreita, média e larga. O espectro mostrado na Figura 7 mostra alguns exemplos de contornos de filtros comuns. O espectro do filtro de emissão na Figura 7 (curva azul) é gerado por um filtro de interferência de longa passagem com um comprimento de onda de corte de cerca de 575 nm. Os comprimentos de onda mais longos são transmitidos pelo filtro, enquanto os comprimentos de onda mais curtos são bloqueados. Filtros de excitação de banda estreita do mesmo grupo (curva vermelha, Figura 7) têm uma largura de banda de cerca de 20 nm, enquanto espelhos bicolores (curva verde) têm uma área de transmissão aproximada média (455-490 nm) e filtros de banda larga (560) -775 nm). Como os espelhos bicolores são usados ​​eficazmente como filtros de longa passagem no verde, as áreas amarelas e vermelhas do espectro visível (560 a 700 nm) são tratadas em conjuntos de filtros. O conhecimento de trabalho sobre como utilizar a distribuição espectral de absorção e emissão do fluoróscopo para escolher o conjunto de filtros de microscópio fluorescente adequado é * para a implementação bem sucedida da técnica.

Os espelhos bicolores (ou espelhos de feixe) são componentes chave na combinação de filtros de microscópio fluorescente, semelhantes aos filtros interferentes de longa passagem, que são fabricados com uma tolerância a materiais dielétricos de múltiplas camadas. A principal diferença entre o espelho bicolor e o filtro de interferência padrão é que o espelho é projetado especificamente para refletir e transmitir sob comprimentos de onda limite limitados e deve operar em ângulo de 45 graus em relação ao eixo óptico do microscópio e do emissor de luz. Posicione o espelho bicolor para que o revestimento de interferência seja orientado para a fonte de luz excitada, de modo que o comprimento de onda de excitação curto seja refletido para a amostra em um ângulo de 90 graus através do sistema óptico. O mesmo espelho também deve servir como filtro de transmissão para transmitir a emissão de longos comprimentos de onda da lente para o plano semelhante. Como a região de transição de comprimento de onda entre reflexão quase total e grande transmissão é geralmente limitada a 20 ou 30 nanômetros, os espelhos bicolores podem distinguir com precisão comprimentos de onda de excitação e emissão.

O conjunto de filtros fluorescentes é projetado para que uma faixa de comprimento de onda de excitação específica corresponda exatamente à área refletida no espelho bicolor. O resultado é que a luz estimulada é efetivamente refletida sobre a amostra através do microscópio. A emissão de fluorescência da amostra deve corresponder à área de alta transmissão no espelho bicolor para que esses comprimentos de onda possam passar pelo detector. Os filtros de barreira são menos importantes em todo o programa, mas ainda desempenham um papel importante na eliminação de comprimentos de onda de excitação de dispersão e reflexão, fluorescência de sondas fora do alvo e intensidade de fundo geral devido à fluorescência espontânea. Um fator importante na criação de um conjunto de filtros é garantir que a curva de transmissão, reflexão e emissão do filtro em causa coincidem com a curva de emissão da área correspondente. Caso contrário, o comprimento de onda estimulado pode ser capaz de atravessar o espelho bicolor e desfocar a imagem, ou a emissão de fluorescência pode ser involuntariamente refletida no espelho para prejudicar o brilho da imagem.

Mesmo em combinações de filtros aparentemente perfeitamente combinadas, podem ocorrer ligeiras sobreposições entre as distribuições espectrais de cada filtro, reduzindo o desempenho. Uma preocupação especial é a interferência entre o filtro de excitação e o espelho bicolor, o que permite que alguma luz excitada seja refletida através do espelho e da parede do bloco de filtro. Como mencionado acima, a luz refletida em um ângulo de inclinação elevada pode passar parcialmente pelo filtro de barreira para reduzir o contraste da imagem. Esse vazamento através do filtro é chamado de penetração ou cruzamento, que ocorre de forma mais ou menos em todas as combinações de filtros. Uma das principais áreas de atenção dos fabricantes de filtros e empresas de microscópios é melhorar o design de combinações de filtros fluorescentes para reduzir os níveis cruzados.

Várias configurações do conjunto de filtros fluorescentes são mostradas na Figura 8. A torre de rotação de blocos de filtro (Figura 8 (a)) contém cinco blocos que podem ser rapidamente convertidos entre combinações de filtros, enquanto o estudo de pelo menos essa quantidade de fluoróforos. Uma delas é normalmente preenchida com blocos ópticos virtuais ou deixada vazia para observação de luz transmissível. Ajuste o espectro de excitação com o Equilibrador de Estimulação (Figura 8 (b)) para imagem de amostras com marcas duplas ou múltiplas, que contêm um único filtro de interferência instalado em uma junta rotativa. A barra reguladora do balanceador de estímulo rotativo permite que a área de transmissão de banda do filtro se mova para comprimentos de onda mais curtos. Assim, quando o filtro do balanceador gira de um ângulo de entrada zero (vertical ao eixo do iluminador vertical) para um grande ângulo de rotação de 45 graus, a área de passagem de banda do filtro pode mover os valores entre 25 e 50 nanômetros. O balanceador de excitação pode ser usado sozinho ou em série para alterar a largura de banda de excitação dos corantes fluorescentes sob observação para que a intensidade de emissão seja igual. Esta característica permite ajustar a intensidade do fluoróforo em amostras que contêm várias sondas, por exemplo, reduzindo a emissão de fluorescência de uma sonda enquanto aumenta a intensidade de outra. O balanceador de excitação pode ser usado sozinho ou em série para alterar a largura de banda de excitação dos corantes fluorescentes sob observação para que a intensidade de emissão seja igual. Esta característica permite ajustar a intensidade do fluoróforo em amostras que contêm várias sondas, por exemplo, reduzindo a emissão de fluorescência de uma sonda enquanto aumenta a intensidade de outra. O balanceador de excitação pode ser usado sozinho ou em série para alterar a largura de banda de excitação dos corantes fluorescentes sob observação para que a intensidade de emissão seja igual. Esta característica permite ajustar a intensidade do fluoróforo em amostras que contêm várias sondas, por exemplo, reduzindo a emissão de fluorescência de uma sonda enquanto aumenta a intensidade de outra.

O rápido desenvolvimento da tecnologia de revestimento de película fina pode ser demonstrado pela capacidade de gerar múltiplos picos de transmissão em um único filtro de interferência e a capacidade de criar faixas de reflexão e transmissão entrelaçadas em espelhos bicolores. Quando adequadamente combinados, dois filtros multibanda e espelhos bicolores podem ser combinados para produzir vários conjuntos de filtros de fluorescência que podem estimular e observar a emissão de vários grupos de fluorescência simultaneamente. Os conjuntos de filtros estão disponíveis do fabricante e são adequados para dois, três ou até quatro fluorescentes na mesma amostra. O principal problema com vários conjuntos de filtros é o seu custo e o excesso de cruzamento ou penetração que ocorre quando a emissão de uma sonda fluorescente passa pela área de banda usada para outra. Em algumas amostras (e grupos de filtros), a penetração teve um impacto significativo na intensidade do fundo e no contraste da imagem. Muitos pesquisadores tendem a usar conjuntos de filtros otimizados para imagem de cada fluoróforo separadamente e, em seguida, combinar a imagem em um complexo.

Tecnologias de fluorescência avançadas geralmente exigem o uso de vários filtros de excitação e emissão com um único espelho bicolor. Para facilitar esses estudos, muitos microscópios fluorescentes são equipados com rodas de filtro elétrico ou deslizantes que contêm mais de seis filtros separados (ver Figura 8 (c)). O microscópio é projetado para uso em deslizantes ou inclui uma ranura especial para a inserção de deslizantes em iluminadores verticais, ou deslizantes de filtro podem substituir deslizantes que normalmente contêm filtros de densidade neutra. Em alguns projetos de microscópio, o emissor de luz vertical também pode acomodar o deslizador de emissão ou um tubo intermediário auxiliar montado entre o emissor e o tubo de observação para acomodar o deslizador. Em microscópios verticais e invertidos, a unidade de filtro elétrico que contém o filtro de excitação é geralmente presa no caminho óptico de iluminação vertical entre o filtro de densidade neutra e a caixa de luz. Da mesma forma, a unidade de filtro de emissão elétrica é colocada entre o iluminador vertical e o tubo de observação do óculo em um projeto de microscópio vertical, mas geralmente conectada através da mesma porta externa do detector usado para o dispositivo invertido. Os deslizadores de estimulação e emissão e as rodas de filtro elétricas são úteis para aplicações de estimulação dupla e tripla usando um espelho bicolor único. Ao eliminar a necessidade de reorientar os blocos de filtro ao observar amostras individuais, esses anexos permitem que os pesquisadores obtenham uma correspondência precisa entre imagens.

Objetivos do microscópio fluorescente

Em todas as formas de microscópio de luz refletida (incluindo a fluorescência), a intensidade da imagem é uma função do valor numérico da lente e da taxa de ampliação. Na verdade, a intensidade ou brilho (definido como o fluxo de fótons por unidade de área e tempo) aumenta o quadrado da abertura numérica, mas apenas em proporção inversa ao quadrado da taxa de amplificação:

Força α (NA obj) 4 / m2

Na qual NA é a abertura numérica da lente e M é o múltiplo de ampliação. A partir desta relação, é evidente que as imagens fluorescentes brilhantes serãoDiâmetro numéricoAggregação com objetivos com baixa taxa de ampliação (por exemplo, 0,75 / 20x). Por exemplo, um objeto de imersão em óleo com diferença de cor complexa planejada 60x com um abertura numérica de 1,4 teoricamente produz uma imagem 100 vezes mais brilhante do que um objeto com o mesmo abertura numérica, mas um compromisso é necessário considerar. Aumentar o número de componentes internos da lente (como com objetos de abertura numérica elevada) produz um aumento correspondente da fluorescência espontânea e do reflexo de redução da intensidade da superfície da lente interna. Normalmente, os fabricantes fazem um compromisso entre um alto fator de correção e um aumento da transmissão da luz em seus objetivos de microscópio fluorescente recomendados.

Em geral, os objetos de alta abertura numérica de óleo (1,3 a 1,4) e água (1,2) submersão planejada fluorescente e plano de decoloração complexa produzem imagens fluorescentes brilhantes devido à sua enorme capacidade de foco. Essas lentes apresentam uma excelente correção de cor e, portanto, são capazes de focar vários comprimentos de onda de emissão fluorescente no mesmo plano. A diferença de cor complexa e as propriedades de transmissão de luz dos objetivos fluorescentes são * quando são baixos até cerca de 350 nm, o que é necessário para verificar os corantes fluorescentes excitados na área ultravioleta (por exemplo, DAPI, Hoechst, Alexa Fluor-350 e AMC). Apesar de haver muitas lentes internas, estas são feitas de vidro de baixa fluorescência com revestimento antireflexo para minimizar a fluorescência de fundo e produzir imagens de contraste muito alto.

Objetivos projetados para aplicações especiais são amplamente utilizados em microscópios fluorescentes. Esta categoria inclui a imersão em água com abertura numérica elevada, imersão múltipla (óleo, água e glicerina) e objetos ultravioletas com elementos de lente de quartzo. Para aplicações de imagem de células vivas, uma lente de longa distância de trabalho com anel de correção é necessária para observar a amostra através da parede da garrafa de cultura espessa (0,5-2 mm). Promove a inspeção de profundidades de amostras espessas com objetivos com distâncias focais muito longas (distâncias de trabalho), que podem ser obtidos de vários fabricantes para imagens de óculos cobertos por ar ou água. Os objetos de mergulho de longa distância projetados para trabalhar sem tampas também possuem um cone frontal de Teflon para que os objetos possam ser mergulhados em solução aquática. Para uma distância de trabalho de 20 a 30 mm (incluindo cerca de 5 mm de água), a excitação ultravioleta na água (340 nm) produz objetivos semelhantes. Para estudos de ampliação relativamente baixa, recomenda-se o uso de uma lente submersa 20 vezes com um * valor de abertura numérica (0,75 a 0,95). Embora muito caros, esses objetivos produzem imagens extremamente brilhantes com concentrações de fluorescente e / ou rendimentos quânticos insignificantes.

Acessórios para microscópio fluorescente

Os fabricantes continuam a produzir unidades de acessórios úteis para seus instrumentos para aumentar as opções disponíveis para as crescentes aplicações de imagem no microscópio fluorescente. Por exemplo, em alguns microscópios, o apendice de campo retangular pode ser selecionado (ver Figura 9), que pode limitar a área da amostra exposta para aumentar o contraste e reduzir o branqueamento de luz. O apêndice de campo modular substitui o apêndice de abertura tradicional (também um módulo desmontável) em iluminadores verticais e é projetado para corresponder às proporções longitudinais dos sensores de imagem digital. A parada de campo retangular melhora a eficiência da iluminação Kohler e reduz a relação sinal-ruído dos sensores eletrônicos. Como um benefício adicional, quando a fase de varredura programável é usada em estudos anticonvulsivos, o tamanho do retângulo da imagem pode ser ajustado para corresponder ao passo da fase. Os orifícios de agulha são semelhantes aos apendices de campo retangular e podem ser usados ​​em aplicações que exigem campos de iluminação altamente limitados.

Outros acessórios incluem um adaptador de caixa de lâmpada dupla que permite que duas fontes de luz, como lâmpadas de descarga de mercúrio e arco de xenão, sejam conectadas simultaneamente à iluminação vertical. Iluminadores para excitação a laser também podem ser usados ​​em aplicações como fluorescência refletida interna total (TIRF), microscópio de imagem de vida fluorescente (FLIM), imagem de proporção e experimentos de recuperação de branqueamento de luz. Além disso, a maioria dos microscópios fluorescentes de nível de pesquisa oferecidos pelos principais fabricantes são facilmente adaptados aos respectivos acessórios confocais de varredura a laser. O microscópio vertical aceita a unidade de varredura confocal através de um tubo de observação triplo, enquanto o instrumento invertido conecta o varredur de feixe à porta lateral ou traseira da estrutura do microscópio. As portas duplas inseridas entre o iluminador vertical e o tubo de observação podem ser usadas para introduzir fontes de luz adicionais ou direcionar a fluorescência para mais de um detector. A maioria desses dispositivos vem com um adaptador de montagem opcional tipo C ou um acessório de porta de microscópio padrão.

O microscópio fluorescente projetado para a pesquisa eletrofisiológica tornou-se muito complexo. Muitos estão equipados com níveis de amortiguação especializados que aceitam uma variedade de acessórios de micromanipulador para experimentos com fluorescência, contraste de interferência diferencial de infravermelho (IR-DIC) e técnicas de imagem de aumento de contraste de campo claro tradicionais. O disco giratório de objetivos oscilantes permite uma rápida troca sem vibração de objetivos para evitar a invasão de amostras ou bolhas que interferam com a imagem de células e tecidos vivos. O uso de novas lentes microscópicas de longa distância de trabalho de 2x e 4x com abertura numérica elevada (objetivos) permite a macroobservação fluorescente em organismos, equipadas com blocos de combinação de filtros especializados. Além disso, alguns fabricantes também oferecem iluminadores verticais fluorescentes e conjuntos de filtros como acessórios para seus microscópios estéreo.

Os iluminadores verticais podem às vezes escolher um fator de ampliação de 1,25 a 1,5 vezes como opção, mas devido a problemas inerentes à introdução de ampliação vazia, o uso de lentes auxiliares para entrar em imagens fluorescentes deve ser evitado sempre que possível. Vários projetos de iluminação vertical modular incluem dispositivos para conectar módulos de divisor contidos em várias portas de câmera acima do iluminador para aumentar a capacidade de imagem. Dada a variedade de acessórios elétricos que agora estão disponíveis para microscópios fluorescentes, incluindo discos rotativos de objetivos, focos, rodas de filtro e plataformas, os pesquisadores podem obter tecnologias de imagem mais sofisticadas do que nunca. Os fabricantes investiram muito esforço no design de acessórios para muitas aplicações de fluorescência complexas que antes só eram construídas com microscópios que usavam peças de várias fontes. À medida que o microscópio fluorescente se torna uma ferramenta cada vez mais importante nos campos da biologia celular, neurofisiologia e clínica

Projeto de microscópio fluorescente invertido

Versões semelhantes de iluminadores fluorescentes verticais podem ser usados ​​para suportes de microscópio invertido (cultura de tecidos). O suporte invertido também permite a combinação ou alternação entre várias técnicas de aumento do contraste para o microscópio de fluorescência refletida e transmissão de luz. O microscópio invertido de nível de pesquisa tem várias (mais de seis) portas de entrada / saída, geralmente com uma única porta em cada lado da estrutura, bem como uma ou duas portas na parte traseira (superior e inferior) e um microscópio de porta inferior na parte inferior Em alguns modelos, a imagem principal pode ser obtida simultaneamente a partir de três ou mais portas sem a necessidade de usar uma lente de relé. Esse nível de conexão permite análises de fluorescência complexas com várias fontes de luz, rodas de filtro e sistemas de câmera. As coberturas de mercúrio e xenão para microscópios invertidos podem ser usadas com lentes de foco multicomponente ou não esféricas padrão para melhorar o desempenho e reduzir a distância de imagem nas áreas espectrais ultravioleta e infravermelha. Além disso, vários adaptadores de caixa de luz podem ser usados ​​para conectar várias fontes de iluminação, semelhantes aos acessórios que podem ser usados ​​para microscópios eretos.

A Figura 10 mostra um esquema de perfil de um microscópio fluorescente moderno invertido (cultura de tecidos) equipado com um sensor de imagem CCD resfriado Peltier e um sistema de câmera de filme de 35 mm convencional. Apesar do filmeCâmeraOs usos são limitados, mas a maioria dos microscópios invertidos ainda incluem portas para esses acessórios na parte inferior da base frontal. O microscópio mostrado na Figura 10 pode usar caixas de lâmpada de tungstênio-halogênio montadas no pilar para executar a iluminação de transmissão de campo claro convencional (com ou sem aumento do contraste). As lâmpadas de descarga de mercúrio ou arco de xenão são usadas em microscópios fluorescentes, usando iluminadores refletidos conectados a portas traseiras configuradas especialmente. Apendices de abertura e campo, bem como filtros de densidade neutra, entram perto das portas na parte traseira do microscópio. Em alguns modelos de microscópio invertido (não mostrados), um iluminador reflexivo em forma de L que contém uma diafragma que pode ser encaixada pode ser usado para melhorar o acesso às portas auxiliares posteriores para acessórios adicionais. O caminho óptico através do microscópio na Figura 10 é amarelo para a luz transmitida, roxo para a iluminação não filtrada da luz do arco, verde para a excitação fluorescente do filtro e vermelho para a emissão fluorescente.

As estruturas de microscópio invertido modernos, como suas contrapartes eretas, são compostos projetados e fabricados por computador para estabilidade estrutural e térmica. Além disso, os componentes da plataforma mecânica e a estrutura do circuito são projetados com distâncias de curto percurso e alta rigidez para evitar inclinações e desvios durante operações convencionais, como a inserção do prisma DIC ou o ajuste do anel de correção da lente. A fase avançada do disco rotativo da lente elimina praticamente o desvio de foco durante atrasos e observações de fluorescência prolongadas. Outras opções de palco que o microscópio vertical padrão não possui incluem palco deslizante e rotativo de 360 graus, placa de palco de vidro, placa de aquecimento, placa de petri e suporte de placa e caixa de dióxido de carbono.

O microscópio invertido com design modular pode ser facilmente configurado para a pesquisa em eletrofisiologia, fertilização in vitro, microoperação, DIC de alta resolução, observação melhorada por vídeo e uma variedade de tecnologias avançadas de fluorescência. Estes instrumentos também são facilmente aplicáveis ​​ao microscópio confocal e multifotônico. Os acessórios elétricos incluem persianas, rodas de filtro, discos rotativos de objetivos rotativos, discos rotativos de blocos fluorescentes, unidades de foco e espelhos de foco. Quando combinados com objetivos avançados de alta distância de trabalho, imersão em água, excitação UV e contraste de fase, todos com correção óptica elevada, o microscópio invertido é o instrumento ideal para realizar estudos de fluorescência de células vivas e tecidos.

conclusão

No microscópio de fluorescência, variações generalizadas entre as concentrações locais de fluorescência dentro da amostra, juntamente com as diferenças no fator de dissipação e rendimento quântico de um corante fluorescente para outro, afetam significativamente o sinal de emissão gerado para uma determinada quantidade de intensidade de excitação. Considerando que muitas amostras contêm apenas traces de material fluorescente em qualquer campo de visão específico, esses fatores combinados produzem níveis médios de emissão de fluorescência de 4 a 6 graus de quantidade menores do que a intensidade de excitação. Além disso, existem algumas técnicas de fluorescência mais sofisticadas, como híbrido in situ e transferência de energia de ressonância (FRET), onde a intensidade do sinal de emissão pode ser de 9 a 10 graus de magnitude menor do que a intensidade do sinal de emissão excitado. Para compensar essas grandes diferenças entre a intensidade de excitação e a intensidade de emissão, os microscópios fluorescentes modernos devem ser capazes de diminuir a exposição à excitação mais de um bilhão de vezes sem interferir com o sinal fluorescente.

Uma das principais características do microscópio fluorescente é a alta especificidade das sondas fluorescentes que caracterizam a absorção e emissão de luz em comprimentos de onda, o que resulta na capacidade da técnica de detectar seletivamente espécies de objetivos em misturas complexas em concentrações muito baixas. Além disso, a alta sensibilidade e a resolução espacial da fluorescência permitem localizar e estudar moléculas individuais com precisão em escalas de comprimento abaixo da resolução óptica do microscópio. Fatores ambientais locais também afetam gravemente a emissão de fluorescência, por isso o método é a sonda ideal para flutuações de pH, viscosidade, concentração de íons, distância molecular e orientação, potencial de membrana, hidrofobia, distribuição de carga e fatores de difusão. A resolução de tempo da fluorescência é limitada à vida útil da sonda de fluorescência excitada, que pode ser de nanossegundos. Como muitos processos biológicos ocorrem neste domínio do tempo, a dinâmica da decadência pode revelar informações dinâmicas sobre os processos celulares. Em geral, esses fatores são essenciais para a aplicação da microscopia fluorescente na biologia celular.

Durante a última década, o microscópio fluorescente evoluiu a um ritmo impressionante, enquanto evoluiu igualmente rápido em tecnologia laser, detectores de estado sólido, fabricação de filmes de interferência e análise de imagem baseada em computador. O desenvolvimento de objetos submersos de abertura numérica elevada contribuiu ainda mais para o estudo de fenômenos biológicos, permitindo que os pesquisadores explorem as células vivas em profundidade em seu ambiente natural. À medida que os fabricantes de microscópios respondem às necessidades em mudança da comunidade de pesquisa, o desenvolvimento de instrumentos e acessórios fluorescentes avançados continuará sem dúvida a evoluir, e sua contribuição final para a exploração dos mistérios da natureza pode eventualmente ter implicações profundas.