Os instrumentos de PCR quantitativa fluorescente (qPCR) são equipamentos essenciais em pesquisas de biologia molecular, diagnóstico clínico (como teste de coronavírus) e outros campos, e sua precisão afeta diretamente a confiabilidade dos resultados experimentais. A correção (calibração) é um passo fundamental para garantir a estabilidade do desempenho do qPCR e requer validação e ajuste sistemáticos regulares do sistema de controle de temperatura (precisão de controle de temperatura) e do sistema óptico (detecção de sinais fluorescentes).

Objetivos principais da correção

A correção do qPCR é projetada para garantir que os seguintes indicadores-chave de desempenho cumpram os requisitos:

Sistema de controle de temperatura: erro de indicação de temperatura (desvio entre a temperatura definida e a temperatura real), uniformidade de temperatura (diferença de temperatura entre os orifícios de reação), volatilidade de temperatura (mudança de temperatura ao longo do tempo), excesso máximo de temperatura (amplitude excedente do valor definido durante o processo de aquecimento / arrefecimento), taxa média de aquecimento / arrefecimento (velocidade de aquecimento / arrefecimento).

Sistema óptico: precisão da intensidade da fluorescência (consistência do mesmo sinal de fluorescência do orifício), precisão do número de ciclos limiar (valor de Ct) (consistência de diferentes valores de Ct do orifício), deriva da temperatura de fusão (valor de Tm) (desvio de temperatura quando a intensidade da fluorescência cai pela metade), coeficiente de correlação linear da fluorescência (relação linear entre a intensidade da fluorescência e a concentração de ácido nucleico).

Preparação antes da correção

1. Condições ambientais

Temperatura: 15-30 ° C (evitar que flutuações de temperatura afetem os resultados de calibração);

Umidade relativa: 20-85% RH (para evitar a umidade do instrumento);

Alimentação: estabilize a tensão (recomendado o uso de UPS) para evitar que cortes de energia afetem o processo de calibração.

2. Equipamentos e materiais

Substâncias padrão: é necessário usar substâncias padrão certificadas (por exemplo, DNA plasmódico, substâncias padrão de ácido ribonucleico), cujos valores magnéticos de propriedades (número de cópias ≥ 106 cópias / μL) e incerteza relativa de expansão (≤ 5%) devem estar em conformidade com os requisitos da JJF (Zin) 04-2020;

Equipamento de calibração: simulador óptico (sensor de temperatura integrado com gerador de luz de emissão, gama de medição de temperatura 0-120 ° C, erro máximo permitido ± 0,1 ° C; comprimento de onda de luz de emissão 360-780 nm, intensidade relativa da radiação da luz ajustável), calibrador de temperatura multicanal (como JDPC-96, para medir a diferença de temperatura entre os orifícios de reação);

Consumíveis: placa de calibração específica (por exemplo, placa de calibração AB7500 ROI, placa de calibração de fundo), pipeta (2μL, 10μL, etc., para medição qualificada), luvas sem pó (placa de calibração contra poluição).

Principais processos de correção

O processo de correção do qPCR deve seguir estritamente a JJF(津)04-2020 "Especificações de Calibração de PCR Quantitativa de Fluorescença em Tempo Real", incluindo principalmente a calibração do sistema de temperatura e a calibração do sistema óptico em duas partes.

Calibração do sistema de temperatura

A temperatura é o parâmetro central da reação qPCR e afeta diretamente a eficiência da amplificação do DNA. A calibração do sistema de temperatura requer o uso de um simulador óptico (em vez do tubo de reação) para simular as mudanças de temperatura na reação real e verificar o desempenho do controle de temperatura do instrumento.

Preparação pré-calibração

Conecte o simulador óptico ao qPCR para garantir que o sensor de temperatura inferior e a fonte de luz emissora de fluorescência superior estejam em bom contato com o bloco térmico do instrumento;

Aplicar óleo condutor térmico sob o simulador óptico para melhorar a condução térmica;

Abra o software do instrumento, selecione o módulo Calibração e abra o programa Calibração de temperatura.

2. Procedimento de calibração

Pré-aquecimento: definir a temperatura do instrumento para 23 ° C, executar o programa de pré-aquecimento (cerca de 10 minutos) para que o instrumento chegue a um estado estável;

Configuração do ponto de temperatura: selecione 9 pontos de temperatura (30 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 90 ℃, 95 ℃, etc.), cada ponto de temperatura dura 2 minutos (para medir o erro de indicação de temperatura, uniformidade, volatilidade);

Processo de aquecimento / resfriamento: aquecimento de 50 ° C a 90 ° C (medição da taxa média de aquecimento), e resfriamento de 90 ° C a 50 ° C (medição da taxa média de resfriamento);

Coleta de dados: o instrumento registra automaticamente a temperatura definida de cada ponto de temperatura (Ts), a média da temperatura real (T1), a flutuação da temperatura (T_v) e o valor máximo de sobrecarregamento (T_os).

3. Cálculo de resultados

Erro de indicação de temperatura: TT = Ts - T1 (exigência ≤ ± 0,5 ℃);

Uniformidade de temperatura: Tu = T_umax - T_umin (T_umax é o valor máximo de temperatura de todos os orifícios, T_umin é o valor mínimo, requer ≤1.0 ℃);

Volatilidade da temperatura: TT_v = ± (T_max - T_min) / 2 (T_max é o valor máximo da temperatura de um único furo, T_min é o mínimo, requer ≤0,2 ℃);

Temperatura máxima de sobrecarregamento: T_os = Tosmax - Ts (Tosmax é o valor máximo de sobrecarregamento de todos os orifícios, requer ≤ 3,0 ℃);

Taxa média de aquecimento: v_up = (TB - TA) / tut (TB é a média do ponto de temperatura de 90 ℃, TA é a média do ponto de temperatura de 50 ℃, tut é o tempo de aquecimento, requer ≥ 4 ℃ / segundo);

Taxa média de resfriamento: v_down = (TB - TA) / tdo (tdo é o tempo de resfriamento, requer ≥ 3 ° C / s).

Calibração do sistema óptico

O sistema óptico é responsável pela detecção de sinais fluorescentes, cuja precisão afeta diretamente os resultados quantitativos do valor Ct e da concentração de ácido nucleico. A calibração do sistema óptico requer uma placa de calibração específica, como a placa de calibração AB7500 ROI, para ajustar a sensibilidade e a consistência do sinal do detector de fluorescência.

1. Calibração de fundo

Objetivo: eliminar a interferência da fluorescência do fundo do instrumento (por exemplo, sinais eletrônicos, poluição de materiais de consumo de plástico);

Passos:

(1) retirar a placa de calibração de fundo (colocar a temperatura ambiente por 5 minutos para evitar a condensação);

(2) carregar a placa de calibração no instrumento e executar o processo de "calibração de fundo" (cerca de 30 minutos);

(3) O software registra automaticamente o sinal de fluorescência de fundo e gera arquivos de correção de fundo (deduzidos automaticamente em experimentos posteriores).

Calibração do ROI (área de interesse)

Objetivo: mapear a posição dos buracos na placa de reação para o detector do instrumento para garantir a coleta precisa do sinal fluorescente de cada buraco;

Passos:

(1) Retire a placa de calibração do ROI (placa padrão ou placa rápida, girar por 5 segundos e centrifugar por 2 minutos);

(2) carregar a placa de calibração no instrumento e executar o processo de "calibração do ROI";

(3) O software captura automaticamente a imagem de cada filtro para gerar uma máscara de ROI (um círculo verde em torno de cada buraco indica que a calibração foi bem sucedida);

(4) Se a imagem for saturada (fluorescência excessiva no buraco), é necessário ajustar o tempo de exposição (por exemplo, reduzir de 2048 para 1024) para recuperar a imagem.

3. Calibração óptica

Objetivo: compensar os efeitos físicos do sistema óptico (como a resposta espectral do filtro) para garantir a precisão do sinal fluorescente;

Passos:

(1) Selecione o programa "Calibração óptica" para carregar o arquivo de calibração do ROI;

(2) Execute o programa (cerca de 10 minutos), o software analisa automaticamente as características espectrais do sinal fluorescente para gerar arquivos de correção óptica.

4. Calibração de corantes

Objetivo: verificar a precisão do sinal fluorescente de diferentes corantes (por exemplo, FAM, VIC, ROX) para garantir a confiabilidade de experimentos com vários corantes;

Passos:

(1) remover a placa de calibração do corante (contendo vários corantes fluorescentes, como CY3, CY5, FAM, etc.);

(2) carregar a placa de calibração no instrumento e executar o processo de "calibração de tintura";

(3) O software coleta automaticamente o espectro de fluorescência de cada corante para gerar arquivos de correção de corante (identificação automática de sinais de corante em experimentos posteriores).

c) Registro de resultados e certificados

Após a conclusão da calibração, é necessário emitir um certificado de calibração certificado pela CNAS, que contém o seguinte:

(1) Informações básicas do instrumento (modelo, número de série, fabricante);

(2) Calibrar as condições ambientais (temperatura, umidade, tempo);

(3) resultados de calibração (erro de indicação de temperatura, uniformidade, precisão do sistema óptico, etc.);

(4) Assinatura do pessoal de calibração e auditor;

(5) Qualificação da instituição de calibração (número de reconhecimento CNAS).

IV. Atenção à correção

1. Ciclo de calibração

A calibração completa é recomendada a cada 12 meses (em conformidade com os requisitos da JJF 04-2020);

com alta frequência de uso (por exemplo, mais de 10 vezes por dia) ou em aplicações críticas (por exemplo, diagnóstico clínico), pode ser reduzido a uma vez por seis meses;

O instrumento precisa ser recalibrado após a mudança, reparação ou substituição de componentes críticos, como blocos de aquecimento, detectores.

2. Apoio profissional

A calibração deve ser realizada por um engenheiro do fabricante ou uma instituição de terceiros qualificada, como o Instituto de Pesquisa Científica de Supervisão Metrológica e Inspeção da Cidade de Tianjin, para garantir a conformidade com o SOP (Procedimento Operacional Padrão);

É proibido que não profissionais ajustem os parâmetros do instrumento por conta própria (por exemplo, ajustes de temperatura, filtros ópticos) para não afetar os resultados da calibração.

Verificação pós-calibração

Após a conclusão da calibração, é necessário executar um experimento padrão de validação de substâncias (como substâncias padrão de DNA plasmídico) para detectar a repetitividade do valor Ct (coeficiente de variação ≤ 3%) e o coeficiente de correlação linear (R² ≥ 0,99) para garantir o efeito da calibração;

Se os resultados da verificação não corresponderem aos requisitos, é necessário recalibrar ou entrar em contato com o fabricante para reparação.

Perguntas frequentes e soluções

A uniformidade da temperatura não cumpre os requisitos

Causas: poluição de bloco térmico médio (por exemplo, resíduos de produtos de PCR), envelhecimento do sensor de temperatura;

Solução: Limpe o bloco térmico uniforme (limpe com etanol sem água) e substitua o sensor de temperatura.

Baixa intensidade do sinal fluorescente

Causa: falha na calibração do ROI (erro de mapeamento do buraco), fluorescência de fundo excessiva;

Solução: Realize novamente a calibração do ROI e execute a calibração de fundo (substitua a placa de calibração de fundo).

Valores de Ct variados

Causa: excedente de volatilidade de temperatura (como bloco de aquecimento instável), diminuição da sensibilidade do detector de fluorescência;

Solução: Verifique a estabilidade térmica do bloco de aquecimento (medido com um calibrador de temperatura multicanal) e substitua o detector de fluorescência.

VI. Resumo

A calibração de PCR quantitativa fluorescente é um passo fundamental para garantir que os dados experimentais sejam precisos e confiáveis e exige a estrita conformidade com os padrões da indústria (como JJF1527-2015, JJF(津)04-2020) e a calibração regular dos sistemas de controle de temperatura e óptica. Durante o processo de calibração, é necessário prestar atenção às condições ambientais, suporte profissional e validação de resultados para garantir que o desempenho do instrumento atenda aos requisitos experimentais. Através de processos de correção padronizados, os erros experimentais podem ser reduzidos de forma eficaz e a precisão e repetibilidade dos resultados da qPCR podem ser melhoradas.