Erro 1: Quanto mais canais do instrumento, melhor

Com o uso maduro da tecnologia de PCR, a amplificação múltipla é cada vez mais vibrante, e o PCR quantitativo fluorescente também não pode ser evitado. Desde o início da empresa ABI lançado pelo desenvolvimento de PCR quantitativa de fluorescência de canal único até o lançamento de PCR quantitativa de fluorescência de 4 canais, 5 canais e até mesmo 6 canais por todos os fabricantes, a escolha deslumbrante deixa as pessoas inconvenientes, alguém acaso entrou no equívoco de "quanto mais canais, melhor".

Quando se usa um quantificador de fluorescência de 5 canais de alguns fabricantes, para garantir a qualidade e a precisão dos resultados experimentais, é necessário usar ROX (um corante fluorescente) ou um corante de referência, todos esses corantes fluorescentes devem usar um canal de detecção separado. Desde então, apenas quatro canais eficazes são realmente capazes de detectar múltiplos sinais de fluorescência de PCR, e o uso de corantes de correção pode aumentar os custos de uso posterior. Alguns canais de detecção de PCR quantitativa fluorescente são abertos apenas para os tintores fluorescentes ou reagentes de seus próprios fabricantes, e os canais de detecção eficazes não são tão numerosos quanto os materiais publicitários. É especialmente importante confirmar os canais de detecção eficazes dos instrumentos de PCR quantitativa fluorescente antes da compra, e não apenas ouvir propaganda. O número de canais de PCR quantitativa de fluorescência múltipla também deve ser considerado a partir da realidade do laboratório, a PCR múltipla não é para todos, porque complica os experimentos.

Erro 2: PCR em tempo real não requer gradiente

Para a reação de PCR quantitativa usando o método de tintura, embora exista uma variedade de software de design de precursor de PCR ou fórmulas empiricas para calcular a temperatura de fusão (valor de Tm), a fórmula usada é diferente, a sequência de precursor é diferente, e a diferença de valor de Tm é grande. A temperatura de fusão do precursor determina a temperatura de cozimento. Além disso, a combinação de bases no modelo varia de milhares de vezes, para fragmentos especiais, os dados obtidos pela fórmula empírica não necessariamente podem obter resultados precisos, as diferenças sutis de temperatura de cozimento podem ter um efeito decisivo sobre os resultados, portanto, a "condição de toque" é uma vez uma dor de cabeça. O surgimento da PCR de gradiente resolve alguns problemas - as condições de controle de temperatura de cada orifício durante a reação podem variar de acordo com o gradiente dentro do intervalo, dependendo do resultado, as condições de reação podem ser descobertas de um passo para o outro.

Não só a temperatura de cozimento, mas também a temperatura de variabilidade e a temperatura de extensão podem ser otimizadas - isso é importante para a maioria das enzimas Taq de alta fidelidade em múltiplas polimerases de amplificação, como Invitrogen, Clontech e Promega, porque as temperaturas de reação * de Taq e enzimas de correção podem variar significativamente, o que torna importante otimizar a temperatura de extensão.

O uso de PCR fluorescente quantitativa com função de gradiente pode completar o processo de otimização que poderia ser concluído em vários experimentos anteriores de uma só vez, simplificando os experimentos onerosos que exploram as condições de resposta da PCR, economizando tempo e custos.