As infecções bacterianas patogênicas representam uma grave ameaça à saúde pública, especialmente em feridas crônicas e agudas, onde a colonização de bactérias e a formação de biofilmes dificultam a cicatrização das feridas. A terapia baseada em oxigênio ativo (ROS), com a vantagem de um amplo espectro de atividade antibacteriana e baixa resistência aos medicamentos, tornou-se uma estratégia não antibiótica para o tratamento de infecções inovadoras. No entanto, sua aplicação clínica ainda está limitada por problemas como a baixa eficiência da administração, a má direcionamento das bactérias e a inflamação descontrolada após o tratamento.

Para isso, a equipe do professor Liwei da Faculdade de Farmácia da Universidade de Wuhan projetou um adesivo multifuncional de microagulha de duas camadas (LFT / S-MN) projetado para esterilizar eficazmente e promover a cicatrização das feridas. O patch liga as nanopartículas de lactefroteina kina (NPs LFT) com carga positiva ao agente sonoro porfirino (TAPPFe) e coloca-as em uma camada de base solúvel, enquanto carrega a droga anti-inflamatória spermidina (SPD) na camada de ponta da agulha em resposta ao pH. Quando a microagulha é inserida no tecido infectado, os NPs LFT liberados são capazes de alvejar e agrupar bactérias de carga negativa de forma eficaz, gerando grandes quantidades de ROS por meio de terapia química dinâmica e sonorodinâmica (CDT / SDT) sinérgica sob estimulação por ultra-som. Ao mesmo tempo, o microambiente ácido da ferida desencadeia a degradação gradual da ponta da agulha, permitindo a liberação controlada da SPD e a imunomodulação. Em modelos de feridas de ratos infectados com a bactéria Copper Verde Falso Monocyte (P. aeruginosa), o patch LFT / S-MN reduziu significativamente a carga bacteriana, inibiu a resposta inflamatória, promoveu o depósito de colágeno e a formação neovascular e acelerou o fechamento da ferida.

Este trabalho propõe uma estratégia promissora não antibiótica para a regeneração de tecidos e antibacterianos de feridas através de CDT / SDT e regulação inflamatória sinergica. Este patch de microagulha é usado com a tecnologia de microlitografia estereográfica (PμSL) de projeção superficial de precisão (microArch). ® S240， Os resultados da pesquisa foram publicados no Journal of Controlled Release com o título “Three-in-one bilayer microneedle patch for ultrasound-activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing”. O estudo de doutorado de nível 2023 da Faculdade de Farmácia da Universidade de Wuhan, Jiangpeng, é o autor da tese, o professor Liwei é o autor da comunicação da tese, a Faculdade de Farmácia da Universidade de Wuhan é a unidade de conclusão da tese, o trabalho de pesquisa acima foi apoiado pelo projeto do Fundo Nacional de Ciências Naturais e pelo financiamento PI do Centro de Medicina da Vida da Tecon da Universidade de Wuhan.

Como mostrado na Figura 1, o adesivo integra uma nanopartícula de lactefroteina (LFT NP) carregada positivamente ligada ao agente acústico porfirina (TAPPFe) em uma camada solúvel e uma ponta de resposta de pH carregada com a anti-inflamatória arginamina (SPD). Após a inserção no tecido infectado, o LFT NP liberado é eficazmente direcionado e agrupado para as bactérias com carga negativa, gerando assim um ROS poderoso por meio de terapia química-dinâmica e acústica sinergica (CDT / SDT) sob estimulação por ultra-som. Ao mesmo tempo, o microambiente ácido da ferida desencadeia a degradação gradual da ponta e a liberação controlada de SPD para imunomodulação. Em modelos de feridas de camundongos infectados por Pseudomonas copper-verde, o patch LFT/S-MN reduziu significativamente a carga bacteriana, inibiu a inflamação, promoveu o depósito de colágeno e a formação de vasos sanguíneos neogêneos e acelerou o fechamento da ferida.

Figura 1. Esquema da estrutura e do mecanismo terapêutico do tratamento de feridas infectadas com patches LFT/S-MN. (A) O projeto e a preparação de placas LFT/S-MN de dupla camada consistem em uma camada de base solúvel que carrega NPs LFT de carga positiva e uma camada de ponta de resposta de pH que encapsula o SPD. (B) Após a inserção da base de infecção, a substância dissolve rapidamente para liberar NPs LFT, NPs LFT alvo ativamente as bactérias com carga negativa e obter a remoção eficaz das bactérias através da sinergia SDT e CDT para produzir ROS sob os EUA. Enquanto isso, o microambiente ácido da ferida desencadeia a degradação da ponta, levando à liberação contínua de SPD para a regulação da inflamação. Essa estratégia conjunta promove a eliminação de bactérias, imunomodulação e regeneração de tecidos, acelerando a cicatrização das feridas.

Para alcançar a especificidade do local e controlar a liberação de drogas, um patch MN de dupla camada em resposta ao pH, chamado patch LFT/S-MN, foi preparado usando estratégias de moldagem sequencial. Para visualização e validação estrutural, duas sondas fluorescentes, rodemina B marcada com soro bovino albina (RhB-BSA) e isocianato de fluorescência (FITC), carregadas na ponta e na base das nanopartículas, respectivamente (Figuras 2A e B). A camada de ponta é sintetizada por polimerização de radicais livres induzida por ultravioleta e cruzamento alcalino de Sif entre poliaçúcar de casca de metil acrílico (CSMA) e SPDTA, com a camada de fundo composta por 18% em peso de álcool polietileno (PVA) e solução de sacarose e a camada de revestimento composta por 20% em peso de poliestireno (PS). A análise de espectroscopia de raios-X de dispersão de energia (EDS) (Figura 2C) mostrou que o ferro dos NPs LFT é distribuído uniformemente, limitado à camada inferior, enquanto que o carbono na ponta é distribuído uniformemente, indicando uma separação espacial evidente. O patch LFT/S-MN obtido é composto por uma matriz de 10 × 10 MN com uma extensão de aproximadamente 0,5 cm2 (Figura 2D). Cada agulha tem uma forma claramente conica, com uma altura de cerca de 850 μm, com uma estrutura de duas camadas evidente (Figuras 2E e F). Os testes mecânicos mostraram que a força de ruptura de cada agulha é de aproximadamente 4N (Figura 2G), o suficiente para permitir uma inserção transcutânea eficaz e aplicações clínicas potenciais.

Figura 2. Caracterização do patch LFT/S-MN. Imagens representativas de campo claro e fluorescente de patches (A-B) LFT/S-MN que ilustram a integridade estrutural e marcadores fluorescentes dos componentes incorporados. (C) Espectrograma de energia confirma a distribuição dos elementos dentro de MNs. (D) imagens ópticas e (E, F) imagens SEM mostram a aparência de LFT / S-MNs. A linha amarela traçada indica a interface entre a ponta de resposta ph e a camada de substância solúvel. (G) A curva de força-deslocamento dos LFT/S-MNs indica que sua força mecânica é adequada à penetração da pele.

Avaliação da penetração cutânea do patch LFT/S-MN com pele de porco separada. Após a aplicação, os MNs romperam com sucesso a corteza e enviaram o corante fluorescente encapsulado para a pele, como mostrado pela imagem fluorescente (Figura 3A), confirmado pela seção transversal histológica (Figura 3B). O comportamento dissolvido e a liberação subsequente de NPs LFT são observados por microscópio fluorescente. Como mostrado na Figura 3C, a base dissolve-se em PBS (pH 7,4) em 80 segundos, promovendo a liberação rápida de NPs LFT da base MN. Considerando que o microambiente da ferida infectada é geralmente ácido, os autores estudaram mais o comportamento de resposta ao pH na ponta do MN. Estudos de liberação in vitro mostraram que a ponta se degradou gradualmente em condições ligeiramente ácidas (pH 5,6), quase decompondo ao dia 15, enquanto que a degradação mínima ocorreu em condições neutras (pH 7,4) (Figura 3D), indicando o comportamento sensível ao ácido da ponta. Quantificar a eficiência de carga e entrega de medicamentos (Figuras 3E e F). O LFT é 145,43 ± 2,76 μg e o SPD é 14,96 ± 0,08 μg. Após administração pela pele, a dose de LFT por MNs foi de 132,83 ± 2,91 μg e a dose de SPD por MNs foi de 14,38 ± 0,22 μg, com uma eficiência de administração superior a 90%. Além disso, a liberação acumulada de SPD em condições ácidas (pH 5,6) atingiu 88,87 ± 3,58% no dia 15, significativamente superior ao PBS (pH 7,4), confirmando ainda mais o espectro de liberação de resposta ácida na ponta do MN (Figura 3G).

Figura 3. Avaliação da liberação de drogas em patches LFT/S-MN. (A) imagens representativas de campo luminoso e microscópio fluorescente da pele isolada de suíno após o implante de patches LFT/S-MN. (B) Fichagem histológica da pele de suíno após o implante de patch MN. (C) imagens ópticas mostram a rápida dissolução da base no PBS e separação da ponta em 80 segundos. (D) Imagens de microscópio de fluorescência inversa mostradas em diferentes condições de pH (pH 7,4 e 5,6), simulando ambiente de ferida neutro e ligeiramente ácido, onde o MN se degrada em 15 dias. (E) Quantificação da carga e entrega de patches LFT/S-MN. (F) Quantificação do carregamento e entrega de patches LFT/S-MN SPD. (G) Curva de liberação in vitro acumulada de SPD em LFT/S-MNs ao longo do tempo. Os dados são representados em média ± SD (n = 3 amostras independentes).

Os autores avaliaram sistematicamente os efeitos antibacterianos in vitro do patch LFT/S-MN. Como mostrado na Figura 4D, a concentração mínima de inibição (MIC) de LFT sob irradiação por ultra-som (3 MHz, 0,97 W / cm2, 50% de ocupação, 30 min) foi de 128 μg / mL. Os patches LFT/S-MN isolados apresentaram atividade antibacteriana moderada, com taxas de inibição de 36,41 ± 0,75% para o Staphylococcus aureus e 35,87 ± 1,48% para o Copper Green False Monocyte (Figuras 4A e E). Em contraste, após a ativação por ultra-som, a taxa antibacteriana do patch LFT / S-MN aumentou significativamente, de 99,95 ± 0,04% e 99,96 ± 0,04%, respectivamente (Figura 4E), indicando que as bactérias estão quase inativas. Tinção SYTO 9/PI verificou ainda mais esses resultados, em que o grupo LFT/S-MN US mostrou fluorescência vermelha predominante, indicando uma extensa mortalidade bacteriana (Figuras 4B e F). O eletroscópio de varredura (SEM) fornece evidências morfológicas adicionais; As bactérias do grupo não tratado mantiveram a membrana intacta e lisa, enquanto as bactérias expostas à ativação por ultra-som LFT / S-MN mostraram danos estruturais e ruptura da membrana significativas (Figura 4C). No geral, essas descobertas confirmam que os patches LFT/S-MN podem produzir grandes quantidades de ROS local após a ativação por ultra-som, eliminando eficazmente as bactérias no local da lesão.

Figura 4. Estudo de propriedades antibacterianas in vitro do patch LFT/S-MN. (A) Fotografia representativa de uma placa de againe, mostrando os efeitos antibacterianos de LFT / S-MNs contra Staphylococcus aureus e Copper-green False Monocytes. (B) imagens de microscópio fluorescente mostram que Staphylococcus amarelodorus e Copper Verde Pseudomonas produzem estresse oxidativo causado pelo ROS em diferentes condições de tratamento. (C) imagem SEM de morfologia bacteriana pós-processamento, mostrando a destruição da membrana e deformação estrutural de Staphylococcus amarelodorus e Copper-verde Pseudomonas. (D) Concentração mínima de inibição (MIC) de Staphylococcus aureus em LFT/S-MNs, mostrando atividade antibacteriana dose-dependente. A seta vermelha indica o valor MIC do LFT. (E) Análise quantitativa da vitalidade bacteriana após diferentes tratamentos, avaliada por coloração viva / morta. (F) As medições correspondentes da intensidade de fluorescência verde (FI) em experimentos vivos / mortos confirmam ainda mais o efeito antibacteriano. Os dados são apresentados em média ± SD (n = 3 amostras independentes). ** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。 ns não é significativo.

Para verificar os efeitos terapêuticos in vivo do patch LFT/S-MN, os autores usaram a bactéria Copper Green (A espécie P. aeruginosaEstabelecer um modelo de infecção cutânea invasiva em ratos (Figura 5A). Os ratos infectados foram divididos aleatoriamente em oito grupos (n = 5 por grupo), incluindo os grupos não ultrassonados (Blank, S-MN, LF/S-MN, LFT/S-MN) e os grupos de tratamento ultrassonado (Blank+US, S-MN+US, LF/S-MN+US, LFT/S-MN+US). O esquema de ultra-som inclui exposição diária de 3 MHz, 0,97 W/cm2, 50% de ocupação, 30 minutos, durante 3 dias consecutivos. A progressão da ferida foi monitorada por fotografia nos dias 0, 1, 3, 5 e 9 após o tratamento (Figura 5B). No dia 1, a infiltração pus do grupo LFT/S-MN+US foi significativamente reduzida, refletindo o efeito antibacteriano combinado de CDT e SDT. Em contraste, o grupo não ultrassonográfico mostrou sepsis e inflamação mais generalizadas. No dia 3, após a conclusão da administração por ultra-som, a amostra do leito da ferida é coletada para a cultura bacteriana e a carga bacteriana residual é avaliada (Figura 5E). A contagem de comprimidos mostrou que as colônias do grupo LFT/S-MN+US foram menos formadas, indicando uma maior atividade antibacteriana no corpo (Figura 5F). No dia 9, os ratos tratados com LFT/S-MN+US tiveram altas taxas de cicatrização de feridas e uma regeneração de tecidos significativa (Figura 5C). Ao longo do tratamento, o monitoramento do peso corporal não mostrou flutuações significativas entre os grupos (Figura 5D), indicando que o patch MN tem boa biocompatibilidade em todo o corpo. Em resumo, esses resultados sugerem que o LFT / S-MN, combinado com o ultra-som, pode ser eficaz para eliminar infecções bacterianas e acelerar significativamente a cicatrização das feridas no corpo.

Figura 5. Efeitos antibacterianos e propriedades de cicatrização de feridas no corpo do adesivo LFT/S-MN. (A) Esquema de um modelo de feridas de ratos infectados por monocytos de cobre verde e estratégias terapêuticas usando patches MN mais ou sem estimulação US. (B) Fotos representativas do local da ferida nos dias 0, 1, 3, 5 e 9 após o tratamento. A bobina preta indica a fronteira inicial da ferida. (C) Análise quantitativa da cicatrização das feridas ao longo do tempo em cada grupo de tratamento (n = 5). Monitoramento do peso corporal do rato durante o tratamento (n = 5). (E) fotos de placas de aguna de colônias bacterianas cultivadas no leito de feridas do dia 3 de cada grupo. (F) Vitalização bacteriana com base na análise de unidades de formação de colônia (CFU) (n = 3). Os dados são expressos em mean ± SD. *** p < 0.001，**** p < 0.0001。 ns não é significativo.

Conclusão:Este estudo desenvolveu com sucesso um patch de microagulha de dupla camada em resposta ao pH (LFT / S-MN) que permitiu um tratamento eficiente de feridas infectadas através da integração de terapia antibacteriana colaborativa ativada por ultrassom (CDT / SDT) com imunomodulação desencadeada pelo microambiente ácido. O patch não só libera rapidamente NPs LFT direcionados às bactérias, gerando grandes quantidades de ROS sob ultra-som para limpar bactérias e biofilmes, mas também libera continuamente SPD em condições ácidas da ferida, regulando a polarização dos macrófagos e inibindo a inflamação excessiva. Experimentos in vitro confirmaram que a estratégia acelera significativamente o fechamento da ferida, promove a regeneração de tecidos e é de excelente biossegurança. O trabalho oferece uma nova estratégia com potencial de transformação clínica para o tratamento de feridas infecciosas e regeneração de tecidos não dependentes de antibióticos.