No paradigma de pesquisa da metabómica tradicional (incluindo lipodômica, abaixo), a metabómica não-direcionada visa obter um perfil metabólico completo da amostra usando espectro de massa de alta resolução, oferecendo uma visão ampla dos metabólitos de pequenas moléculas; A metabólica direcionada usa principalmente espectroscopia de massa tripla e quadrupolar para alcançar a quantificação precisa dos metabólitos. À medida que a necessidade de análise de amostras em grande escala se expandiu, os pesquisadores começaram a buscar um equilíbrio entre a alta cobertura da análise metabólica não-alvo e a alta precisão da análise alvo, iniciando técnicas de metabómica em grande escala (incluindo metabómica amplamente alvo e pretendido alvo, sem fazer distinção neste artigo).

A metabólica em massa concentra-se em mais de milhares de metabólitos centrais do organismo, coletando amostras diretamente na plataforma de espectroscopia de massa triplo quadrupolar usando o modelo de monitoramento de reações seletivas (SRM) ou monitoramento de reações múltiplas (MRM), garantindo a cobertura de metabólitos, ao mesmo tempo, pode melhorar significativamente a sensibilidade e a especificidade da detecção de metabólitos de baixa abundância, despedir-se do incômodo de processamento de informações em grandes quantidades em análises não direcionadas, fornecendo uma gama dinâmica mais ampla de detecção de metabólitos, reprodutividade de dados mais robusta e precisão quantitativa relativa, fornecendo uma base de dados sólida e confiável para análise de amostras em massa. No entanto, sujeito às restrições da velocidade de varredura triplo quadropolar de espectroscopia de massa, geralmente apenas 1 a 2 íons por metabólito são retidos para garantir o fluxo de análise do metabólito, reduzindo a confiabilidade da identificação do metabólito.

Thermo Scientific ™ Stellar ™ Espectro de massa com Orbitrap Ascend ™ Quad pólos, armadilha de íons linear de dupla pressão e Orbitrap Astral ™ O detector PMT permite uma velocidade de varredura sem precedentes no espectro de massa de armadilha iônica linear. Ele foi pioneiro em aplicar o modelo de Monitoramento de Reações Paralelas (PRM), desde os instrumentos Orbitrap até a espectroscopia de massa de armadilhas iônicas, permitindo análises qualitativas e quantitativas sincronizadas em metabólica em larga escala que permitem tanto a precisão quanto a confiabilidade quantitativa da identificação de metabólitos.

Thermo Scientific ™ Stellar ™ Espectrómetro de massa

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O Stellar MS suporta a conversão de dados de alta resolução não-alvo, abrindo o loop fechado de "descoberta-validação"

Uma das estratégias clássicas da metabómica em massa é a conversão de dados DDA coletados por espectroscopia de massa de alta resolução em pares de íons MRM programados que podem ser validados por padrões SRM, realizando um ciclo fechado de "descoberta-validação". Hoje, esse fluxo de trabalho pode ser facilmente implementado na conversão de dados de espectroscopia de massa de alta resolução do Orbitrap para o método Stellar PRM, como mostrado na Figura 1. Compound Discoverer ™ Software e mzVault ™ Software pode converter metabólitos identificados em padrões de espectro de massa DDA de alta resolução em Stellar ™ Lista de espectro de massa compatível com PRM e biblioteca de espectro de massa secundário (.msp), assim como o TraceFinder ™ ou Skyline ™ O software é usado para o trabalho quantitativo e qualitativo de metabólicos. Skyline ™ O software PRM Conductor permite otimizar automaticamente os canais de captação de PRM programados para reduzir o efeito do fluxo de metabólitos na velocidade de digitalização. Descobrimos que as mesmas amostras de plasma são extremamente altamente reprodutíveis nos resultados de escaneamento completo de espectroscopia de massa de alta resolução e nas análises de PRM Stellar (característica de triagem de CV de amostragem repetida de três pinos < 30%), sugerindo que a espectroscopia de massa Stellar pode validar marcadores metabólicos encontrados não alvo em níveis de amostra em grande escala.

Figura 1 Processo de desenvolvimento e demonstração dos resultados do método de metabómica em massa Stellar PRM baseado em espectroscopia de massa de alta resolução (clique para ampliar)

02

O Stellar MS suporta transferência rápida de métodos triplos e quadrupolares para quantificação qualitativa sincronizada

Se o usuário já desenvolveu métodos de análise metabólica direcionados ou amplamente direcionados em plataformas de espectroscopia de massa triplo quad-polar, Stellar ™ O espectro de massa também permite uma rápida transferência dos métodos originais. Sob a premissa de que o tempo de retenção é altamente reprodutível (o mesmo sistema de fase líquida), Stellar ™ Espectrómetro de massa pode converter diretamente listas SRM / MRM para métodos PRM; Mesmo que o tempo de retenção não possa ser reproduzido em diferentes sistemas cromatográficos, o usuário pode trabalhar diretamente no Stellar ™ O instrumento é rapidamente armazenado através da coleta de misturas, atualizando o tempo de retenção de compostos e espectrogramas secundários. Ao contrário dos métodos tradicionais de SRM/MRM, o modelo PRM fornece um espectrograma secundário completo dos metabólitos a serem testados, permitindo a quantificação qualitativa sincronizada dos metabólitos sem a necessidade de adicionar canais de captação adicionais em detrimento do fluxo analítico dos metabólitos, aumentando ainda mais a confiança na identificação dos metabólitos. (Figura 2)

Figura 2. Análise pretendida de características metabólicas capturadas por espectro de massa de alta resolução pela Stellar PRM (clique para ampliar)

O ácido biliar é o produto final do metabolismo do colesterol, o ácido biliar primário no corpo humano pode ser convertido pela flora intestinal em ácido biliar secundário mais ativo, com um papel importante no organismo para manter o equilíbrio do colesterol, regular o metabolismo glicolipídico e a resposta inflamatória. Antes da Thermo Scientific ™ TSQ Altis ™ Método de quantificação de ácido biliar construído em um espectrômetro de massa triplo quadrupolo, transferido rapidamente para Stellar através do processo mostrado na Figura 3 ™ Em MS, 33 ácidos biliares endógenos foram alcançados para quantificação qualitativa sincronizada.

Figura 3. Ácido biliar SRM/MRM lista PRM método de transferência e quantificação qualitativa sincronizada (clique para ver a imagem maior)

03

O Stellar MS suporta o desenvolvimento inicial de lipodômica direcionada para a quantificação precisa de triglicerídeos

Os lípidos, devido ao seu tempo de retenção previsível e espectro de massa secundário, são ideales para análises de alvo. Skyline ™ A função LipidCreator do software permite gerar espectros de massa secundários de vários íons de adição de lípidos para uso direto no desenvolvimento de métodos lipodômicos direcionados. Acilcarnitina (AcCar) é uma das substâncias-chave que regulam o equilíbrio metabólico glicolípido nos mamíferos, ajudando não apenas a transportar os ácidos graxos para as mitocondrias para oxidação beta, mas também para a geração de cetonas envolvidas na regulação do metabolismo do açúcar. Pesquisas confirmam que a lipidylcarnitina está estreitamente relacionada com várias doenças metabólicas e é atualmente amplamente utilizada no diagnóstico clínico de doenças metabólicas genéticas em recém-nascidos. A lipidcarnitina possui íons fragmentados específicos (m/z 144, m/z 85, m/z 60 e perda neutra de cadeia de ácidos graxos específicos) que podem ser obtidos diretamente usando a previsão LipidCreator. Aplicando o modelo Stellar PRM, identificamos 207 e 340 espécies de acilcarnitina no plasma e na urina, respectivamente, como mostrado na Figura 4.

Figura 4. Identificação de etil-carnitina pelo método Stellar PRM

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O Stellar MS suporta a varredura conjunta de espectroscopia de massa em vários níveis para análise precisa de isômeros

Na análise lipídica, a quantificação de triglicerídeos (TG) com três cadeias de gordura é particularmente desafiadora. Por exemplo, a quantificação de TG (50:4) usando o padrão SRM/MRM, independentemente da perda neutra de cadeia de gordura utilizada, só pode determinar a composição de uma delas, por exemplo, a quantificação de fragmentos de perda neutra FA16:0 (m/z 573,7) só pode demonstrar a presença de FA16:0 na TG (50:4), mas não pode obter informações sobre a composição das duas cadeias de ácidos graxos restantes. O Stellar MS3A composição das três cadeias de gordura do TG pode ser localizada com precisão para obter quantificações precisas de triglicerídeos (Figura 5).

Figura 5. Quantificação precisa de triglicerídeos pelo método Stellar tMS3

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Espectro de massa Stellar sem necessidade de configurar MS separadamente3O método pode ser usado para quantificação metabólica diretamente em paralelo ao padrão PRM, aumentando significativamente a flexibilidade do método. Além da quantificação de triglicerídeos, MS3Também pode ser usado para a quantificação precisa de isômeros, como o ácido de glicina desoxi-colesterol (GCDCA) e o ácido de glicina desoxi-colesterol (GDCA) da família dos ácidos biliares, que podem aumentar a MS ao mesmo tempo que a quantificação PRM3Os canais aumentam sua sensibilidade quantitativa e precisão de identificação (Figura 6).

Figura 6. Isoméricos de ácido biliar Stellar tMS3 para quantificação precisa

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A tecnologia de metabómica em massa ultrapassa os limites da redundância de dados metabómicos não-direcionados tradicionais e da baixa cobertura de análises direcionadas, permitindo que um único experimento obtenha uma triagem completa de milhares de metabólitos, ao mesmo tempo em que obtém alta sensibilidade e alta reprodutividade para análises direcionadas comparativas. Thermo Scientific ™ Stellar ™ O surgimento do espectro de massa marca um salto revolucionário na tecnologia de análise metabólica em massa, que combina a excelente quantificação do espectro de massa quadropolar e a forte capacidade qualitativa de armadilhas de íons lineares de dupla pressão, acelerando a velocidade da pesquisa científica para a transformação clínica, impulsionando enormemente a metabólica em estudos de cohorte clínica, cenários de aplicação de análise de amostras em massa, como mapeamento metabólico nutricional personalizado, com dados mais precisos para revelar os profundos mistérios do metabolismo da vida.

Referências:

1. Zhou J, Yin Y. Estratégias para quantificação metabolômica direcionada em grande escala por cromatografia líquida-espectrometria de massa. [J] Analista. 2016; 141(23):6362-6373.

2. Zheng F, Zhao X, Zeng Z, et al. Desenvolvimento de um método de metabolômica pseudoalvo de plasma baseado em espectrometria de massa de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho. Nat Protoc. 2020; 15(8):2519-2537.

3. Chiang JY. Ácidos biliares: regulação da síntese. [J] J Lipid Res. 2009; 50(10): 1955-1966.

4. Di Yu, Lina Zhou, Qiuhui Xuan, et al. Estratégia para a identificação abrangente de acilcarnitinas com base em cromatografia líquida-espectrometria de massa de alta resolução. [J] Anal. Química. 2018, 90(9), 5712–5718.

5. Lauren Bishop, Brittany Lee, Charles Maxey, et al. Combinando abordagens MS2 e MS3 direcionadas para a quantificação de ácidos biliares em espécimes biológicas usando o espectrómetro de massa estelar. Thermo Fisher Scientific, Inc. (em inglês)

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