Preface

Anticorpos-conjugados de drogas de pequenas moléculas (ADCs) são uma classe de produtos biológicos terapêuticos que podem identificar com precisão as células alvo através de anticorpos, liberando drogas de pequenas moléculas acopladas depois de entrar nas células alvo através da ingestão, alcançando o objetivo de matar com precisão as células alvo e minimizando a morte de células normais. Devido ao princípio de design do ADC, que é descrito como "biomíssil", o primeiro medicamento ADC Mylotarg foi lançado em 2000. ® Após a aprovação da gemtuzumab ozogamicina pela FDA, em junho de 2025, 19 ADCs foram aprovados no mercado em todo o mundo. Desde que as vendas globais de ADC ultrapassaram os 10 bilhões de dólares pela primeira vez em 2023, as vendas globais de ADC continuaram a ultrapassar os 10 bilhões de dólares em 2024, mantendo um forte crescimento.

Entre os dez ADCs mais vendidos em todo o mundo em 2024, o segundo é o KADCYLA da Roche. O medicamento foi aprovado pela FDA em 2013 para o tratamento de câncer de mama HER2 positivo, com vendas globais de cerca de US $ 2,3 bilhões em 2024. O emtracutazumab é um ADC direcionado para HER2 que contém o emtracutazumab anti-HER2 IgG1 humano, que se liga covalentemente ao medicamento inibidor de microtubulação DM1 (derivado da metancina) através do conector de enxofre estável MCC (4-[N-malaimidmetil]ciclohexano-1-carboxato), com distribuição de peso molecular de 147 a 158 kDa, com distribuição da relação droga/anticorpo (DAR) de 0 a 8, com uma média de aproximadamente 3,5 [3]. Devido à complexidade de sua estrutura, é difícil caracterizá-la. Neste estudo, usamos o que acabamos de publicar na Conferência Anual de Espectroscopia de Massa dos Estados Unidos (ASMS) deste ano.Espectrômetro de massa 2 em 1 de alta resolução Excedion Pro BiopharmaA caracterização abrangente do KADCYLA demonstra a excelente capacidade analítica da plataforma no campo biofarmacêutico, especialmente a função de dissociação de colisão de transferência de eletrões/energia superior (EThcD), que ajuda a identificar com precisão os locais de acoplamento de medicamentos e a identificação de modificação pós-tradução (PTM).

Aplicar destaques

Como mencionado anteriormente, a nova geração de espectrômetros de massa 2 em 1 de ultra alta resolução Excedion Pro Biopharma foi lançada este ano para a caracterização aprofundada do KADCYLA. Os destaques do instrumento incluem, mas não se limitam a, a extensão do alcance de detecção de massa para m/z = 12.000 Da (opção BioPharma necessária), capaz de atender à medição de peso molecular de anticorpos monoclonais monoméricos / dímeros / triméricos e outros complexos de proteínas de grande massa molecular em condições não degenerativas; A função ETD opcional permite a fragmentação ETD/EThcD rápida e sensível, em combinação com a Dissociação Colisional de Alta Energia (HCD), para obter uma ampla cobertura de sequências de proteínas e informações de identificação PTM. A estrutura do instrumento Excedion Pro Biopharma é mostrada na Figura 1, e a Figura 2 mostra o processo de caracterização aprofundada do KADCYLA neste experimento.

Diagrama da estrutura do Excedion Pro BioPharma, com a seção de atualização de hardware em comparação com a geração anterior destacada em azul no gráfico. O alcance do teste de qualidade pode ser expandido para m/z=12.000 Da (seção caixa verde) com a BioPharma Edition opcional e a fraturação ETD/EThcD (seção caixa vermelha) com o ETD opcional. (Clique para ver a imagem)

Figura 2. KADCYLA caracteriza o diagrama de fluxo.

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Determinação do peso molecular completo do KADCYLA em condições não degenerativas

A medição do peso molecular completo é essencial para a caracterização de produtos biofarmacêuticos e, para ADC, além do peso molecular completo, o valor médio do DAR e a distribuição da carga de droga (DLD) também são atributos-chave para avaliar a qualidade do medicamento. Neste experimento, realizamos medições de peso molecular completo do KADCYLA em condições não degenerativas. As condições não degenerativas usam um sistema de sal tampão neutro, onde as moléculas de proteína estão mais próximas de seu estado natural do que as condições degenerativas, e as proteínas são menos carregadas em condições não degenerativas, com menos sobreposição de picos de massa entre os estados de carga vizinhos, reduzindo a interferência mútua entre sinais espectrais de massa e ajudando a obter resultados mais precisos de medição do peso molecular completo. A Figura 3 mostra os resultados da medição do peso molecular completo em condições não degenerativas do KADCYLA. Para aproximar a amostra do seu estado natural, não a desaçucaramos. Como pode ser visto na Figura 3A, no nível do espectrograma original, o pico espectral de massa de diferentes números de drogas e diferentes componentes de açúcar acoplado basicamente alcançou a separação de linha de base, e a distribuição de acoplamento de drogas de 0 a 8 pode ser claramente observada após a convolução (Figura 3B), o software BioPharma Finder pode calcular automaticamente o valor médio do DAR, o valor médio do ADC é de 3,47 (Figura 3C), consistente com o 3,5 relatado na literatura.

(A)

(B)

(C)

Figura 3. Resultados da medição do peso molecular completo do KADCYLA em condições não degenerativas. A, Espectrograma original e ampliação local. B, Desenvolvimento do espectrograma. C. O software BioPharma Finder seleciona automaticamente os componentes relevantes e calcula o valor médio do DAR. (Clique para ver a imagem)

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Fragmentação secundária EThcD dependente de dados para análise peptídica,

Posicionamento de locais acoplados e identificação PTM

A análise peptídica baseada na ligação líquida é um dos métodos analíticos mais comuns na caracterização de produtos bioterapéuticos, permitindo a cobertura de sequências, localização de várias modificações químicas e análise qualitativa e quantitativa de modificações pós-traduzidas comuns. Em várias técnicas de fragmentação de espectro de massa, como a fragmentação de HCD é capaz de produzir íons fragmentados b / y ricos para a identificação de segmentos peptídicos após a interrupção de ligações peptídicas, é amplamente utilizada na análise de gráficos peptídicos. No entanto, para alguns segmentos peptídicos modificadores, como os peptídicos glicóticos, os segmentos peptídicos ligados a sub-droga, etc., como o HCD quebra a cadeia de açúcar / ligado a sub-droga, para segmentos peptídicos com vários locais modificadores potenciais, o fracasso do HCD não pode localizar os locais modificadores com precisão; Além disso, para alguns segmentos peptídicos que contêm aminoácidos isomerizados, como leucina / isoleucina, aspartina / aspartina isomerização, etc., não é possível distingui-los devido à mesma massa de íons b / y produzidos pelo HCD. E o ETD, devido ao mecanismo de reação diferente, pode quebrar o esqueleto do segmento peptídico ao mesmo tempo que mantém a cadeia de açúcar completa, conexão de sub-acoplamento farmacêutico e outras modificações da cadeia lateral, para os aminoácidos isomerizados, também pode produzir íons de diagnóstico característicos, para alcançar a identificação e distinção dos aminoácidos isomerizados. A adição de fragmentação auxiliar de HCD, EThcD, com base na fragmentação de ETD, permite obter íons b / y e c / z simultaneamente no mesmo espectro secundário, obtendo informações mais abrangentes para a caracterização dos segmentos peptídicos, especialmente os segmentos peptídicos modificados / isomerizados. O espectrômetro de massa ultra-alta resolução 2-em-1 Excedion Pro é equipado com a opção ETD para a fragmentação rápida e sensível de ETD/ETchD, configurando o modo de aquisição de dados de fragmentação secundária de EThcD dependente de dados (data dependent EThcD MS2, dd EThcD MS2) para complementar a fragmentação secundária de HCD dependente de dados (dd HCD MS2) para obter informações abrangentes sobre a análise do peptidograma.

Neste estudo, KADCYLA foi alterada usando duas proteases Trypsin e AspN, respectivamente, e, posteriormente, dados de dd HCD MS2 e dd EThcD MS2 foram coletados em amostras de duas proteases diferentes para obter informações como cobertura de sequência, distribuição de sites acoplados e modificação pós-tradução. As amostras utilizadas com dd HCD MS2, Trypsin e AspN alcançaram uma cobertura sequencial de 100% em uma única injeção (dados não apresentados). A Figura 4 mostra o cromatograma de pico de base (BPC) e a cobertura de sequência da análise peptídica de amostras com a enzimolase dd EThcD MS2, Trypsin e AspN, que também pode alcançar uma cobertura de sequência de 100% em uma única amostra, demonstrando que a fragmentação ETD / ETchD do espectrômetro de massa de alta resolução 2 em 1 Excedion Pro é compatível com a cromatografia líquida de fluxo convencional para obter um espectrograma secundário de alta qualidade para análise peptídica.

Diagrama de péptido KADCYLA analisa a cobertura do pico de base e da sequência, ambos em modo de coleta de dados de dd ETchD MS2. À esquerda, amostra de enzima tripsina. À direita, amostras de enzima AspN. Para diferentes amostras de protease enzima, uma única agulha de amostragem pode alcançar 100% de cobertura de sequência. (Clique para ver a imagem)

Como mencionado anteriormente, o subconector-fármaco do KADCYLA (MCC-DM1) é acoplado à lisina por meio de ligação covalente, e o N-terminal do tretumab também é acoplado, de modo que existem 92 locais potenciais de acoplamento para toda a molécula do KADCYLA, dos quais 46 não são repetidos (Figura 5). Como a lisina é acoplada covalentemente e produz uma resistência espacial de bits, resultando em vazamentos de tripsina, a enzimolase de tripsina produz segmentos peptídicos de ligação sub-farmacêutica que contêm várias lisinas, enquanto a fragmentação do HCD quebra simultaneamente o esqueleto do segmento peptídico e a droga acoplada, o que torna impossível determinar com precisão os locais de ligação farmacêutica apenas com espectro de HCD secundário. Enquanto o EThcD, devido ao mecanismo de fragmentação diferente, pode fracturar o esqueleto do segmento peptídico ao mesmo tempo que mantém os grupos acoplados ao medicamento, a energia de fragmentação auxiliar do HCD otimizada pode fazer com que o segmento peptídico seja fracturado mais completamente, mantendo ao mesmo tempo a droga totalmente acoplada. A tabela 1 mostra a fragmentação secundária de amostras enzimáticas de tripsina usando HCD e EThcD, respectivamente, a informação do local de acoplamento do fármaco obtida é resumida, dos 46 locais potenciais de modificação, 43 locais de modificação do fármaco foram identificados, a fragmentação do EThcD é visível, para segmentos peptídicos que contêm vários locais potenciais de acoplamento, o local de acoplamento pode ser localizado com precisão, combinado com os resultados do HCD, informações detalhadas e abrangentes do local de acoplamento podem ser obtidas.

Todos os locais potenciais de modificação da molécula KADCYLA, marcados em caixas vermelhas na sequência da proteína, têm um total de 92 locais, dos quais 46 não são repetidos.

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Tabela 1. Resumo dos locais identificados pela KADCYLA

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Fonte vermelha, ponto de ligação. "++", os locais acoplados podem ser identificados por íons de fragmento secundário. "+", a ligação está presente no segmento peptídico, mas a localização específica da ligação não pode ser confirmada por íons fragmentados. "-", a ligação não foi identificada.

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Quando o KADCYLA é enzimático com AspN, a cadeia pesada produz um segmento peptídico D que contém três lisinas.K(216)K(217)VEPK(221)SC， E através da análise peptídica de amostras de trypsina, é possível que todas as três lisinas estejam ligadas. O conector MCC-DM1 do medicamento KADCYLA contém um centro isomérico (Figura 6, superior esquerda), o que faz com que os segmentos peptídicos acoplados ao medicamento sejam lavados em picos na cromatografia de fase inversa. Como mostrado na Figura 6, devido à presença de vários locais potencialmente acoplados e centros de isomerização MCC-DM1, o segmento peptídico DK(216)K(217)VEPK(221)O mapa de fluxo de íons de extração (Extract ion current, XIC) do SC apresenta vários grupos de picos. Graças ao espectrograma secundário rico em informações gerado pela fractura do EThcD, é possível identificar com precisão a localização em que o segmento peptídico lavado por diferentes tempos de retenção foi acoplado (Figura 6, abaixo) e a proporção relativa de cada modificação pode ser calculada com base na área do pico XIC (Figura 6, superior direita).

Figura 6. Identificação de sites acoplados por EThcD para segmentos peptídicos que contêm vários sites acoplados. (Clique para ver a imagem)

Para amostras de ADC, além dos locais de acoplamento do medicamento, várias modificações pós-traduzidas relacionadas à qualidade do medicamento também precisam ser caracterizadas e monitoradas. Figura 7 mostra um espectrograma de fraturação secundária baseado em EThcD, para o segmento peptídico FNWYVisoD(283)Resultados da identificação da isomerização do ácido aspartico de GVEVHNAK. Graças à alta sensibilidade e precisão de qualidade da plataforma instrumental, mesmo que o conteúdo relativo seja de apenas 0,18% do segmento peptídico isomerizado não modificado, ainda é possível identificar íons c / z ricos, bem como íons c + 57 / z-57 característicos gerados pela isomerização de aspartina na fração ETD, permitindo a confirmação da isomerização de aspartina. Resultados quantitativos relativos podem ser obtidos para outras modificações pós-tradução comuns, tais como desamida, oxidação e glicosilação (Figura 8).

Figura 7. Isomerização do ácido aspartínico confirmada usando fração EThcD. Os íons c+57/z-57 podem ser observados com a ampliação local abaixo. (Clique para ver a imagem)

Figura 8. Outros resultados quantitativos relativos modificados após tradução comum, todos com médias de amostragem repetida de dd ETchD MS2 de três pinos. A, Oxidação de metilina. B, Destamina de aspartamida. C, Ambramilação da aspartamida. D, Oxidação da trônica. E, N-glicosilação de cadeia pesada. (Clique para ver a imagem)

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Resumo

Este artigo apresenta os resultados experimentais da caracterização do ADC KADCYLA ligado à lisina com o espectrômetro de massa ultra-alta resolução 2 em 1 de nova geração Excedion Pro BioPharma. A medição do peso molecular completo do KADCYLA em condições não degenerativas permitiu medir a distribuição do número de ligações farmacêuticas de 0 a 8 em condições sem desaçucarização, com um valor médio de DAR de 3,47 após o tratamento por software, consistente com o relatado de 3,5; Fragmentação rápida e sensível de EThcD não só pode alcançar 100% de cobertura sequencial de amostragem única, identificação de modificação pós-tradução comum e quantificação relativa, mas também pode alcançar identificação de locais acoplados, identificação de aminoácidos isomerizados, etc., fornecendo resultados confiáveis ​​para a caracterização completa de biomoléculas complexas.

Referências:

[1] Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. Conjugado de drogas anticorpos: o "míssil biológico" para a terapia direcionada do câncer. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C., Denevault-Sabourin, C. Conjugados anticorpos-drogas: a última década. Farmacêutica 2020, 13, 245.

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