Resumo

A tecnologia de eletrotransformação viva da retina de ratos recém-nascidos fornece um instrumento fundamental para o desenvolvimento da retina e a pesquisa de doenças. Os pesquisadores otimizaram os parâmetros de conversão elétrica com o eletroporômetro de onda quadrada Gene Pulser 830 da Venetian, permitindo a entrega e a expressão eficientes de genes estrangeiros na retina de ratos recém-nascidos, melhorando significativamente a eficiência da transfecção e fornecendo uma plataforma tecnológica confiável para pesquisas básicas relacionadas à retina e medicina conversiva.

Introdução

A retina, como um tecido essencial para a transmissão de sinais visuais, tem sido um ponto quente no campo da oftalmologia. A retina de camundongos recém-nascidos está em um estágio de desenvolvimento rápido, quando a manipulação genética pode efetivamente estudar o papel dos genes na diferenciação, migração e construção funcional das células da retina. No entanto, os métodos tradicionais de entrega de genes apresentam problemas de baixa eficiência e danos celulares na operação da retina viva, que são difíceis de atender às necessidades de pesquisa científica precisa.

A tecnologia de conversão elétrica muda instantaneamente a permeabilidade da membrana celular através de campos elétricos de pulso, permitindo que grandes moléculas como ácidos nucleicos estrangeiros entrem nas células, mostrando vantagens na entrega de genes para tecidos vivos. Com a sua tecnologia avançada de pulsos de onda quadrada, o sistema de monitoramento inteligente e a configuração flexível de parâmetros, o Gene Pulser 830 fornece uma solução eficiente e precisa para a bioeletroconversão da retina de ratos recém-nascidos, ajudando os pesquisadores a superar os gargalos da tecnologia tradicional.

Materiais e métodos

1. Animais de Experimento

Ratos recém-nascidos C57BL/6J 0-2 dias após o nascimento (P0-P2), fornecidos por uma sala de animais de classe SPF neste laboratório, alimentados a temperatura ambiente (22 ± 2) ℃, umidade 50% -60%, 12 horas de luz / escuridão ciclo.

2. Reagentes principais

DNA plasmódico (contendo o gene GFP destinado, construído neste laboratório), um reagente (para a preparação de tampão eletrotransportável, contendo NaCl, KCl, glicose, etc., pH ajustado para 7,4), anestésico (isoflúoro, para anestesia em ratos), reagente de desinfecção (75% etanol).

3. Principais instrumentos

Electroporador de onda quadrada Gene Pulser 830 da Venetian, microscópio telescópico (marca específica para observação de operações cirúrgicas), agulha de microinjeção (diâmetro externo 10-15 μm para injeção de plasmídio), placa de aquecimento termostática para manter a temperatura corporal do rato.

Passos experimentais

1. Anestesia e fixação do rato

Os ratos recém-nascidos foram colocados em uma caixa de anestesia contendo isoflúoro e transferidos para uma placa de aquecimento termostática após a anestesia induzida para manter a temperatura corporal estável. Fixe suavemente a cabeça e os membros do rato com fita para garantir a estabilidade do rato durante a cirurgia.

2. Localização da retina e injeção plasmática

Sob microscópio somatico, extrair o DNA plasmídico do gene de destino (concentração de 1-2 μg / μL) com uma agulha de micro-amostra, inserir lentamente a ponta da agulha na cavidade do corpo de vidro para evitar o cristalino e injetar com precisão 5-10 μL de solução plasmídica na cavidade da retina inferior. Controle atentamente a profundidade e velocidade da agulha durante a injeção para evitar danos ao tecido da retina.

3. Configuração e operação de parâmetros de perfuração elétrica

O electroperforador de onda quadrada Gene Pulser 830 da Venetian utiliza um sistema de otimização pré-programado para selecionar o padrão de transfeção de células de mamíferos para as características do tecido da retina de ratos recém-nascidos, chamando os parâmetros recomendados de células da retina incorporados: pulso de onda quadrada, voltagem ajustada de acordo com a idade do rato e o tamanho do globo ocular (geralmente 50-80V), tempo de pulso de 10-20ms, número de pulsos 3-5 vezes, intervalo de pulso de 1-2s.

Mantenha o eletrodo de pinça personalizado (1-2 mm de distância entre os eletrodos, a superfície é isolada para evitar vazamentos de corrente) suavemente no olho do rato para garantir que o eletrodo se encaixe bem na superfície do olho e não pressione o olho. Iniciando o processo de perfuração elétrica através de um interruptor de pé, a tela táctil de 10 polegadas do instrumento mostra a dinâmica das formas de onda de pulso e parâmetros em tempo real, facilitando o monitoramento de todo o processo. Durante o processo de electroperfuração, o instrumento realiza automaticamente uma detecção inteligente de impedância, mede a resistência da amostra pré-pulsada e ajusta dinamicamente os parâmetros para garantir que cada condição de choque eletrônico corresponda ao estado das células da retina. Ao mesmo tempo, a proteção do arco e a tecnologia de conversão polar eliminam danos do arco, quebram a barreira de carga da membrana celular e aumentam a taxa de sucesso das células difíceis de transferir.

4. Tratamento pós-operatório

Após a operação de rotação, mova o rato de volta para a mãe para manter o ambiente quente e silencioso. O estado dos olhos e a sobrevivência dos camundongos são observados diariamente após a cirurgia para garantir a ausência de infecções e outras complicações.

Resultados e discussões

Detecção de Eficiência de Transfecção

Após 3 dias após a rotação eletrônica, extrair os globos oculares do rato, preparar o corte congelado da retina e observar a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) através de um microscópio fluorescente. Os resultados mostraram que o sinal fluorescente da GFP era visível em todas as camadas da retina, especialmente nas camadas ganglionárias, nucleosas e externas, com uma eficiência de transfeção superior a 40% em comparação com os métodos tradicionais (com base em dados de testes internos da Venetian). Isso é possível graças ao campo elétrico de alta intensidade do eletroporógrafo de onda quadrada Gene Pulser 830 da Venetian, que repercute instantaneamente na permeabilidade da membrana celular, permitindo a entrega eficiente de macromoléculas de ácidos nucleicos.

Avaliação da sobrevivência celular e danos nos tecidos

A estrutura do tecido da retina foi observada através da coloração de Sumicin-Irrigan (HE), com todas as camadas da retina de ratos eletrotransformados claras, as células ordenadas e sem necrosis celulares ou respostas inflamatórias significativas em comparação com o grupo controle. O experimento de exclusão azul de Taipan mostrou que a taxa de sobrevivência das células da retina após a eletroconversão foi superior a 90%, indicando que a tecnologia de eletroconversão danificou o tecido da retina de forma pequena, garantindo a viabilidade de experimentos posteriores.

Vantagens comparativas com a tecnologia tradicional

Os métodos tradicionais de transmissão de veículos virais apresentam problemas como ciclos de preparação longos, custos elevados e capacidade limitada de veículos e podem desencadear uma resposta imunológica. A tecnologia de conversão eletrônica em vivo, mediada pelo eletroporosor de onda quadrada Gene Pulser 830 da Venetian, fornece diretamente grandes moléculas, como DNA, RNA e proteínas, sem a necessidade de embalagem viral, o que facilita a operação rápida e de baixo custo, evitando ao mesmo tempo os potenciais riscos dos portadores de vírus. Seu sistema de monitoramento inteligente em forma de onda completa garante que o processo experimental seja transparente e controlado e que os dados sejam rastreáveis, facilitando a reprodução precisa dos resultados da pesquisa científica. O sistema de otimização pré-programado incorpora uma biblioteca de parâmetros de cepas celulares comuns, chamadas com um clique, enquanto suporta parâmetros de pulso personalizados, adaptados a cenários complexos como a retina de ratos recém-nascidos, mostrando uma grande flexibilidade e aplicabilidade.

Otimização técnica e precauções

Durante os experimentos, descobriu-se que a otimização dos parâmetros de eletroporação é um fator-chave que afeta a eficiência da transfecção. Tensões elevadas ou frequências excessivas de pulsos podem causar danos celulares, enquanto uma tensão baixa é insuficiente para a eficiência da transfecção. A capacidade de detecção inteligente de impedância do Gene Pulser 830 da VENIDER resolve esse problema de forma eficaz, ajustando os parâmetros dinâmicos de acordo com a resistência da amostra. Além disso, a concentração e o volume de plasmídeos injetados, o grau de adaptação dos eletrodos e a idade diária dos camundongos podem afetar os resultados do experimento e exigir um rigoroso controle das condições experimentais.

Perspectivas de aplicação

Áreas de Pesquisa Básica

Esta técnica pode ser amplamente aplicada ao estudo funcional de genes relacionados com o desenvolvimento da retina, como a tecnologia de edição de genes CRISPR combinada com a conversão elétrica, que pode realizar a eliminação ou introdução de genes específicos da retina, estudando seu papel na diferenciação celular da retina e na formação de circuitos nervosos; A entrega de siRNA pode ser usada para inibir a expressão do gene alvo e explorar os mecanismos dos genes na ocorrência de doenças da retina; No estudo da reprogramação de células-tronco, a tecnologia de conversão elétrica pode importar fatores de reprogramação eficientemente nas células-tronco da retina, oferecendo novos caminhos para a pesquisa em medicina regenerativa da retina.

Transformação de Medicina

Em termos de eletrotransformação de tumores vivos, pode ser dirigido a tumores oculares como retinoblastoma, através da eletrotransformação para fornecer genes terapêuticos ou medicamentos, para alcançar o tratamento direcionado preciso; No desenvolvimento de vacinas, a tecnologia de conversão elétrica pode enviar os antígenos para as células imunológicas relacionadas à retina, induzindo uma resposta imunológica e fornecendo novas ideias para a pesquisa de vacinas oculares; Em termos de terapia genética in vivo, para doenças hereditárias da retina, como retinite pigmentada, negromia congênita, etc., a tecnologia de conversão elétrica pode importar genes normais para as células da retina, estabelecendo a base para a aplicação clínica da terapia genética.

Agricultura e Indústria

Embora a pesquisa se concentre na retina de camundongos recém-nascidos, a ampla utilização do eletroporosor de onda quadrada Gene Pulser 830 da Venetian também oferece um grande potencial para a agricultura e a indústria. Na modificação genética de plantas, pode ser usado para a entrega de genes de protósomos vegetais, acelerando a melhoria das variedades agrícolas; Na construção de bactérias engenharias de levedura e engenharia metabólica microbiana, a tecnologia de conversão elétrica pode efetivamente realizar a importação de genes estrangeiros e melhorar a eficiência de produção de bactérias engenharias.

O electroperfurador de onda quadrada Gene Pulser 830 da VENID, com sua inovadora tecnologia de pulso de onda quadrada, sistema de monitoramento inteligente e suporte técnico profundo, é a escolha de confiança de mais de 500 instituições científicas líderes. Seja a manipulação genética precisa na pesquisa básica ou a exploração terapêutica inovadora na medicina transformacional, o dispositivo fornece uma plataforma tecnológica eficiente e confiável para os pesquisadores. Atualmente, a VENIDE oferece consultoria gratuita sobre soluções técnicas e serviços de teste de produtos para ajudar os pesquisadores a superar as barreiras tecnológicas à transfecção e promover a pesquisa em ciências da vida e áreas relacionadas.

Referências

1. Alterações na expressão genética associada à angiogenese e ao estresse oxigênico em retinopatia de ratos recém-nascidos induzidas por oxigênio [J] . Yu Zhengyang , Gong Chen Yuan , Zhang Guoqing . Comunicado de Farmacologia da China. 2014, número 010

2. Expressão de quimoproteína monocelular-1 em um modelo neonatal de ratos retinopatia induzida por oxigênio [J] . Dong Ning , Gangli , Sholin . Revista Ocular Experimental Chinesa. 2012, número 004

3. Expressão de quimoproteína monocelular-1 em um modelo neonatal de ratos retinopatia induzida por oxigênio [J] . Dong Ning , Gangli , Sholin . Revista Ocular Experimental Chinesa. 2012, número 004

4. Alterações e significado da expressão de MCP-1 no tecido da retina de ratos recém-nascidos [J] . Dong Ning , Jili Group , Shaoling . Medicina de Shandong. 2011, número 026

5. Expressão de MMP-2 em modelos neonatais de ratos com retinopatia prematura [J] . Ginger Shuang , Chen Xiaolong . Jornal da Faculdade de Medicina de Liaoning. 2009, número 006