O híbrido molecular é um dispositivo central para a detecção de ácidos nucleicos (DNA / RNA) ou proteínas em pesquisa de biologia molecular e é amplamente utilizado em áreas como análise de expressão genética e detecção de mutações. Suas operações devem seguir rigorosamente processos padronizados para garantir a precisão dos experimentos. Aqui está o processo completo de uso e os pontos-chave:

Preparação Antes do Experimento

1. Preparação de amostras e sondas

- Extração de ácido nucleico alvo (por exemplo, DNA genômico, mRNA) para fins experimentais, transferência para suporte de fase sólida (membrana de nylon / PVDF) após separação por corte enzimático e eletroforese.

- Sonda de marcação: a pureza e a concentração da sonda devem ser verificadas através de uma sonda de oligonucleótidos específicos marcados com isótopos (³²P), corantes fluorescentes ou biotina.

2. Inspeção de instrumentos

- Confirme que o sistema de controle de temperatura do híbrido é normal, a função da cama oscilante é estável e o anel de vedação não está danificado pelo envelhecimento.

- Antecipe o pré-aquecimento do instrumento até a temperatura definida (geralmente de 42 a 65 ° C, dependendo do tipo de sonda), reduzindo o efeito da flutuação da temperatura na eficiência do híbrido.

3. Configuração do Reagente

- Preparar líquido pré-híbrido (contendo DNA de salmão, SDS e outros agentes de fechamento), líquido híbrido e líquido de lavagem com concentração de sal gradiente, prestando atenção à filtração e desinfecção para evitar a poluição.

Etapas operacionais principais

1. Pré-hibridação

- Coloque a membrana que fixa o ácido nucleico a ser testado no tubo de híbrido, acrescente uma quantidade suficiente de membrana de imersão pré-híbrida e incube a temperatura definida por 1-2 horas. Esta etapa visa fechar os locais de ligação não específicos na membrana para reduzir o ruído de fundo.

- * Controle crítico *: manter uma oscilação leve para facilitar a circulação do líquido e evitar a formação de bolhas.

2. Reações híbridas

- Eliminar o líquido pré-híbrido, adicionar diretamente o líquido híbrido com a sonda marcada (a concentração final da sonda é geralmente de 1-10 ng / mL) e continuar a incubação oscilante suave durante a noite (8-16 horas).

* Estratégia de otimização *: Temperatura de híbrido = Tm -5 ℃ (Tm é a temperatura de desencadeamento da sonda), considerando a especificidade e a sensibilidade.

3. Classificação da película

- Limpar em secções com um líquido de lavagem que reduz a concentração de sal em sequência (por exemplo, usando 2 x SSC → 0,5 x SSC → 0,1 x SSC), removendo gradualmente as sondas não ligadas ou mal combinadas.

- * dica de operação *: absorver o líquido residual antes de cada troca de líquido, lavagem de alta rigor pode melhorar a especificidade, mas lavagem excessiva pode levar à perda de sinal real.

Detecção de sinais e análise de dados

1. Coleta de imagens

- Escolha o método de detecção correspondente de acordo com o tipo de marcação da sonda: autoexibição radioativa requer raios-X pressionados; O uso de imagens CCD por fotoemissão química; As sondas fluorescentes podem ser digitalizadas diretamente.

* Controle de Exposição*: Ajuste o tempo de exposição para evitar a saturação e sincronizar o controle de espaço para excluir a interferência do fundo.

2. Interpretação dos resultados

- Análise quantitativa utilizando o software ImageJ para calcular a escala de cinza da faixa, avaliando semi-quantitativamente o nível de expressão genética; A análise qualitativa concentra-se na posição da faixa com a consistência do peso molecular esperado.

* Tratamento anormal*: se aparecer uma faixa não específica, é necessário re-otimizar o design da sonda ou aumentar a rigor da lavagem.

Reparação e manutenção

1. Eliminação de resíduos

- Os resíduos contendo isótopos são tratados de acordo com as especificações de resíduos radioativos e os reagentes fluorescentes / quimicamente luminescentes são reciclados em recipientes especializados.

2. Manutenção do instrumento

- Esvaziar o líquido dentro do tubo híbrido, lavar com água limpa, banhar com etanol de 70%, calibrar o sensor de temperatura regularmente.

- Registrar os parâmetros deste experimento (temperatura, velocidade, tempo) no registro do equipamento para referência no experimento posterior.

A operação do híbrido molecular requer um controle preciso da temperatura, do tempo e do ambiente da solução, e qualquer desvio de ligação pode levar a resultados falsos positivos / falsos negativos. Recomenda-se que os usuários iniciais conduzam experimentos controlados paralelos e determinem as melhores condições de cruzamento através de pré-experimentos. A operação padronizada é acompanhada de medidas de controle de qualidade rigorosas para garantir a confiabilidade dos resultados experimentais.