1- Amostragem microbiana: Como muitos micróbios podem crescer repetidamente em placas de resina, o primeiro passo é encontrar as condições de cultivo certas. A técnica simples e comum de cultivo de células em placas de agar permite uma preparação de amostras conveniente. Por exemplo, as bactérias são cultivadas primeiro em quadrantes de diferentes densidades celulares em placas de resina por 16 a 24 horas para obter resultados muito confiáveis. Coleta colônias apenas do terceiro quadrante. O estudo descobriu que a chave para o sucesso do método está na padronização das condições de coleta e na consistência do crescimento das bactérias nas placas de resina. Algumas melhorias também podem ser feitas (por exemplo, mudar para um meio líquido ou alterar o tempo/temperatura da cultura). No entanto, é necessário garantir que todas as medições sejam realizadas nas mesmas condições para obter resultados confiáveis.

2- Tecnologia de medição de bactérias: as técnicas usadas para a identificação microbiana exigem simplicidade e alta repetibilidade. Quando a solução microbiana seca lentamente, as células microbianas produzem biofilmes sólidos. Ao otimizar este processo, obtém-se um processo de preparação de amostras fácil de operar e satisfaz a repetibilidade necessária para medições de infravermelho. A luz infravermelha penetra na biopelícula e é absorvida por diferentes partes das moléculas presentes na célula, gerando impressões digitais químicas específicas de cada cepa testada.

Para a identificação microbiana FT-IR, nossa principal preocupação é a precisão dos resultados, que dependem fundamentalmente da qualidade da biblioteca de referência. A biblioteca de espectros de micróbios é diferente da biblioteca geral e, para garantir a confiabilidade dos resultados, é necessário criar uma biblioteca sistemática em condições padronizadas.

Em primeiro lugar, é necessário garantir a reprodutividade dos micróbios. O meio de cultura, as condições de cultura (como tempo, temperatura) e pré-tratamento de amostras têm efeitos no espectro infravermelho, portanto, essas condições exigem procedimentos operacionais padronizados.

Em segundo lugar, a heterogeneidade e variabilidade durante o pré-tratamento da amostra (como o volume da amostra, o grau de secagem da membrana, etc.) e os fatores de medição (como a dispersão de luz causada pelas partículas da amostra, etc.) podem afetar a espectrograma infravermelha. Portanto, é necessário fazer várias medições da mesma amostra para garantir a reprodutividade da espectrograma infravermelha.

Em terceiro lugar, a credibilidade das amostras desconhecidas para a identificação por infravermelho é baseada na credibilidade do espectro de referência. Portanto, as cepas de referência devem ser identificadas usando métodos confiáveis. Caso contrário, informações incorretas na biblioteca podem levar a desvios no resultado final da identificação. A combinação de várias áreas espectrais significativas permite a construção de um banco de dados de cepas bacterianas conhecidas. Para classificar e identificar bactérias desconhecidas, as informações espectrais são comparadas com bancos de dados de referência de bactérias conhecidas, mostrando que os padrões espectrais correspondem a cepas desconhecidas de micróbios. A semelhança dos diferentes espectros microbianos também pode ser descrita graficamente na forma de mapas em forma de árvore.