Colunas de cromatografia líquida

Colunas de cromatografia líquida

O sistema de cromatografia de fase líquida é composto por um armazenador, bomba, amostrador, coluna cromatográfica, detector, gravador e várias partes. A fase de fluxo no depósito é introduzida no sistema pela bomba de alta pressão, a solução da amostra entra na fase de fluxo através do introdutor da amostra e é carregada na fase de fluxo na coluna cromática (fase fixa), devido a que cada componente da solução da amostra tem um coeficiente de distribuição diferente em duas fases, quando se faz movimento relativo em duas fases, após vários processos de distribuição de adsorção e desabsorção repetidos, cada componente produz uma grande diferença na velocidade de movimento, é separado em componentes individuais que saem da coluna, quando a concentração da amostra é convertida em sinal elétrico para o gravador, os dados são impressos em forma de mapa.

Estrutura de princípio

[1] Estrutura da coluna de cromatografia líquida:

a 、 A coluna vazia é composta de junções de coluna, tubos de coluna e filtros

A junta de coluna usa uma estrutura de baixo volume morto, a junta de coluna é um componente de rosca de duas extremidades, uma extremidade é rosca interna de 7/16 polegadas e a outra extremidade é rosca interna de 3/16 polegadas (padronizada em casa e no exterior). A rosca interna de 7/16 polegadas é ligada a um tubo de coluna de 1/4 polegada (Φ6,35 mm) com um anel de pressão colocado no meio para vedação. A rosca interna de 3/16 polegadas é ligada a um tubo de conexão de 1/16 polegadas (Φ1,57 mm), com um anel de pressão também colocado no meio para a vedação da junção do pilar. Para minimizar o volume morto fora da coluna, ao instalar a coluna cromatográfica, use um tubo de conexão de Φ1,57 mm para inserir o máximo possível até o fundo depois de pressionar o anel de parafuso oco e, em seguida, apertar o parafuso oco. O anel de pressão é deformado pela extrusão de parafusos ocos O anel de aperto posterior está no tubo de conexão (o comprimento do tubo exposto após o tubo de conexão passar pelo anel de pressão deve ser estritamente controlado em 2. 5mm de comprimento ou outro tamanho fixo).

Dentro da junção de coluna de ambas as extremidades, um filtro de aço inoxidável (ou filtro) é colocado em cada extremidade do tubo de coluna para bloquear a perda de preenchimento da coluna sem ser fluído para fora da coluna. Os componentes da coluna vazia são de aço inoxidável 316L e podem suportar o efeito geral do solvente. No entanto, como o solvente que contém cloreto tem alguma corrosividade, deve-se ter em conta que o solvente não pode ser mantido por muito tempo dentro da coluna e do tubo de conexão para evitar a corrosão.

b 、 Embalagem de coluna:

A separação da coluna de cromatografia líquida é realizada entre o recheio e a fase de fluxo, e a classificação da coluna depende do tipo de recheio. Colunas em fase frontal: muitas colunas são preenchidas com silicone. Dependendo da aparência pode ser dividido em amorfos e esféricos, com diâmetros de partículas na faixa de 3-10 μm. Outro tipo de preenchimento de fase ortogonal é a ligação superficial de silicone - grupos funcionais como CN, -NH2, chamados de silicone de fase ligada. Coluna de fase inversa: preenchimento não polar, principalmente baseado em silicone, ligado ao grupo funcional octalaquilo (ODS) em sua superfície. Também não há distinção entre estereotipo e bola.

Outros preenchimentos de fase inversa comumente usados ​​também ligam C8, C4, C2, fenilo, etc., com tamanhos de partículas entre 3 e 10 μm. Requisitos de preenchimento

O preenchimento de coluna cromatográfica comumente usado é o gel de silicone ligado químicamente. O sistema de cromatografia de fase inversa usa um preenchimento não polar, com silicone de ligação de octa-alquilo-silicone como comumente usado, silicone de ligação de octa-silicone e outros tipos de silicone de ligação de silicone (como silicone de ligação de ciano e silicone de ligação de amino, etc.) também são usados. O sistema de cromatografia ortofásica usa preenchimento polar, o preenchimento comumente usado é o silicone, etc. Sistema de cromatografia de troca iônica usando preenchimento de troca iônica; O sistema de cromatografia de bloqueio molecular usa um preenchimento como gel ou microesferas porosas de polímeros; A separação de isômeros de mapeamento é geralmente utilizada com preenchimento manual.

As propriedades do preenchimento (como a forma do veículo, tamanho de partícula, abertura, área de superfície, cobertura de superfície do grupo de ligação, teor de carbono e tipo de ligação, etc.) e o preenchimento da coluna cromatográfica afetam diretamente o comportamento de retenção e o efeito de separação da amostra. O preenchimento com um diámetro inferior a 15nm (1nm = 10Å) é adequado para analisar compostos com pesos moleculares menores que 2000, e compostos com pesos moleculares maiores que 2000 devem escolher preenchimento com um diámetro superior a 30nm. Salvo disposição em contrário, o tamanho das partículas de enchimento da coluna de análise é geralmente

1

entre 3 μm e 10 μm. O preenchimento de partículas menores (cerca de 2 μm) é frequentemente usado para preencher a coluna de diâmetro micro (cerca de 2 mm de diâmetro interno), quando a coluna de diâmetro micro é usada, o desempenho da bomba de infusão, o volume de amostragem, o volume da piscina de detecção e o volume morto do sistema devem corresponder a ele; Se necessário, as condições cromatográficas também devem ser ajustadas adequadamente. Em caso de controvérsia sobre a determinação, prevalecerá a determinação das condições cromatográficas especificadas no corpo da variedade.

Requisitos de temperatura

A temperatura de uso da fase fixa de ligação comum de silicone como veículo geralmente não excede 35 ° C, para melhorar o efeito de separação pode melhorar adequadamente a temperatura de uso da coluna cromatográfica, mas não pode exceder 60 ° C.

Requisitos da fase de fluxo

O pH da fase de fluxo deve estar entre 2 e 8. Quando o pH é superior a 8, o silicone transportador pode ser dissolvido; Quando o pH é inferior a 2, a ligação química ligada ao silicone é facilmente hidrolizada. Quando o sistema de cromatografia precisa usar uma fase de fluxo com pH maior que 8, preenchimento resistente a álcalis deve ser escolhido, como preenchimento de silicone ligado com silicone de alta pureza como veículo e com alta cobertura superficial, preenchimento de polímero revestido, preenchimento de hibridação orgânica e inorgânica ou preenchimento não-silicone, etc.; Quando a fase de fluxo com pH inferior a 2 é necessária, um preenchimento resistente ao ácido deve ser escolhido, como diisopropilo ou diisobutílio com cadeias laterais de grande volume que podem produzir efeitos de proteção de bits espaciais em vez de preenchimento de silicone ligado a octalaquilsilão ou preenchimento de hibridação orgânica e inorgânica.

Precauções

Efeito da coluna e coluna de proteção da coluna cromatográfica

Ao obter uma nova coluna, certifique-se de primeiro olhar para a sua instrução de fazer, em seguida, medir o efeito da coluna, verificar regularmente o efeito da coluna, manter o cromatograma obtido na nova coluna cromatográfica e registrar as condições, verificar regularmente a largura de banda espectral do instrumento. Para aplicações de monitoramento on-line, as colunas cromatográficas devem fornecer proteção física e química on-line, por exemplo, instalando filtros on-line, colunas de proteção de preenchimento e colunas de proteção pré-instaladas. O papel do filtro on-line é impedir que as partículas se acumulem na cabeça do cilindro, a vantagem é que basicamente não afeta o efeito do cilindro, comumente usado quando a alta eficiência do cilindro é necessária, os produtos de consumo frequentemente substituídos são o elemento de filtro e o papel da coluna de proteção da junta é impedir que o cilindro seja contaminado químicamente. A desvantagem é que a maioria das colunas de proteção afeta o efeito da coluna cromatográfica, especialmente quando se usa uma coluna microscópica, a coluna de proteção comum de preenchimento auto-carregado é comumente usada. Recentemente, algumas colunas de proteção, como a coluna de proteção de S e n t r y g u a r d, são caracterizadas por embalagem de alta qualidade e eficiente, aumento do efeito da coluna de análise, grande capacidade de carga para amostras sujas, pode prolongar a vida da coluna de proteção, a mão pode apertar a junção, não precisa de ferramentas durante a instalação, poupança de tempo, design de núcleo intercâmbito, pode usar uma variedade de embalagens diferentes, principalmente aplicável a amostras muito sujas e muito complexas, como amostras bioquímicas, amostras ambientais e alimentos, ou não quer fazer muita extração de fase de jardim, não quer reduzir o efeito da coluna, etc.

Limpeza de colunas cromatográficas

Para ter uma compreensão completa da amostra feita, com a capacidade de lavagem da amostra zui forte fase de fluxo de limpeza, para a coluna de silicone, primeiro com metanol para lavar as impurezas polares, em seguida, com diclorometano seco e gentano positivo 1 0 0 - 2 0 O r aL ativado, para ligações e colunas de fase, geralmente com metanol metanol e água, cada coluna cromatográfica tem métodos de limpeza específicos, certifique-se de ler suas instruções de uso

Armazenamento de colunas cromatográficas

Remova as impurezas e o sal antes do armazenamento, use o solvente de armazenamento adequado, evite a secagem do leito de coluna cromatográfica, evite a vibração mecânica, evite o crescimento das bactérias e preste atenção à temperatura do armazenamento.

Resolução de problemas

1, pressão elevada

2

Pode ser um bloqueio de partículas. Inflação do leito de coluna, adsorção irreversível, crescimento de bactérias, etc. Também podem haver problemas de contrapressão do sistema, como bloqueio do amortiguador, bloqueio do amostrador, bloqueio de tubulação ou conexão. Os filtros on-line não são limpos, os sensores de pressão não são precisos, etc.

2, baixo efeito de coluna

Pode ser causado pela poluição da coluna cromatográfica, bloqueio parcial do filtro, volume morto dentro da coluna cromatográfica, por exemplo, valor de p H da fase de fluxo ou uma composição inadequada causando perda de fase fixa. Alterações drásticas na fase de fluxo causam danos físicos na fase fixa, vibrações mecânicas causam rachaduras na fase fixa, contração ou secagem do leito de coluna.

Também pode haver problemas com a conexão do instrumento, verificar cuidadosamente se o amostrador, o detector, a tubulação, a coluna de proteção e o filtro on-line estão bem conectados, ou pode ser que a coluna cromatográfica não esteja bem equilibrada, o volume de amostragem é muito grande e outros problemas.

3, má repetitividade, sem pico, baixa taxa de recuperação

Pode ser que a coluna cromatográfica esteja contaminada, o valor de p H da fase de fluxo ou a composição inadequada causem perda de fase fixa, o solvente da amostra seja diferente ou a própria amostra seja instável, a polaridade da fase fixa seja muito forte ou a polaridade da fase de fluxo seja muito fraca. Ou ocorrer uma adsorção não específica. Também pode haver tempo insuficiente de equilíbrio durante experimentos de gradiente, flutuações de temperatura, mudanças na composição da fase de fluxo, solventes diferentes da amostra, má estabilidade da amostra, mau desenvolvimento de métodos, acidez inadequada ou capacidade insuficiente de tampão do tampão.

Até que não haja bolhas na tubulação (da garrafa de solvente à entrada da bomba), alterne o canal e continue a Purge até que todos os canais a serem usados estejam livres de bolhas.

10, clique no ícone de bomba, aparece o menu de configuração de parâmetros, clique na opção de controle de bomba, selecione Off, clique em Ok para desligar a bomba e feche a válvula de purga.

Clique no ícone da bomba, o menu de configuração de parâmetros aparece, clique na opção Setup pump, vá para a tela de edição da bomba e defina o fluxo: 1.0ml/min.

Clique no ícone da garrafa abaixo da bomba, como mostrado na imagem (usando a bomba binária como exemplo), digite o volume real do solvente e o volume da garrafa. Também é possível inserir o volume da bomba. Clique em OK