20024904 Kit de sequência illumina v2.5 em stock

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Marca do produto: Illumina

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A tecnologia de sequência de segunda geração da llumina, a Sequência de Borda Sintética (SBS), é a tecnologia de sequência de nova geração (NGS) amplamente adotada, responsável pela geração de mais de 90% dos dados de sequência do mundo.

A tecnologia de sequência de segunda geração da Illumina é chamada de Sequência por Síntese (SBS). SBS consiste principalmente em três etapas: extensão de base, excitação fluorescente e coleta de sinal, corte. Estes três passos podem ser repetidos e o ciclo é realizado. Determine uma base de cada ciclo. Para determinar quantas bases (ou seja, comprimento de leitura), quantas vezes você deve fazer um ciclo. O número de ciclos de sequência pode ser configurado no software. Quanto tempo é adequado para a sequência é decidido de acordo com a natureza e as necessidades do projeto. Na maioria dos casos, o experimento SR (sequenciamento de extremo único) determina 1x50 bases e o experimento PE (sequenciamento de extremo duplo) determina 2x150 bases.

1 Extensão da base

Os dNTP utilizados nos reagentes de sequência Illumina são caracterizados por ter dois grupos modificadores simultaneamente: um grupo fluorescente e um grupo terminante reversível. As quatro bases A, G, C e T marcam quatro grupos fluorescentes diferentes, que podem emitir fluorescência de diferentes comprimentos de onda (ou seja, cores) sob excitação de laser de diferentes comprimentos de onda. A cor fluorescente corresponde ao tipo de base, portanto, a base pode ser reconhecida de acordo com o comprimento de onda da luz excitada. Os grupos terminais de quatro bases são os mesmos. Devido à presença de grupos terminados, todos os dNTPs podem estender apenas uma base de cada vez, independentemente do tempo de reação dado. Como o grupo de terminação é reversível, após a coleta do sinal fluorescente, o grupo de terminação pode ser removido com um cortador para que a base retorne ao estado natural estendível, então você pode continuar com o próximo ciclo e determinar uma base.

A tecnologia de grupo de terminação reversível é uma característica importante do secunciamento da segunda geração da Illumina. Juntamente com a tecnologia de PCR ponte, constitui os dois pilares do secunciamento de segunda geração da Illumina, estabelecendo uma base sólida para o acesso estável a dados de sequenciamento de alta qualidade.

2 Captura de sinais

A série HiSeq tem dois tubos laser vermelho-verde e dois filtros de cores. Combinados, eles podem formar quatro comprimentos de onda de excitação diferentes, exatamente usados ​​para excitar quatro bases A, G, C e T, respectivamente.

Os sinais gerados por grupos fluorescentes marcados no cluster, excitados pelo laser, podem ser capturados ou digitalizados por câmeras. A tecnologia de digitalização é mais rápida e é adotada pela série X10. Como a área do FC é relativamente grande, e a superfície superior e a superfície inferior devem ser fotografadas separadamente, o processo de fotografia é bastante demorado. Para o clássico HiSeq 2000, o sinal fluorescente gerado por um ciclo de sequenciamento demora cerca de 40 minutos para a coleta de fotos, mais tempo do que a própria reação de sequenciamento.

3 corte

Após a coleta do sinal fluorescente, desligue o laser e use um cortador para remover os grupos fluorescentes marcados na base do produto de extensão do precursor sequenciado e os grupos terminados. Ambos os grupos modificadores foram removidos, eliminando a fluorescência interferente e, por um lado, tornando a base no extremo da cadeia ao estado natural estensível, preparando-a para a próxima rodada de sequenciamento.

Repita as etapas de síntese, excitação, coleta, etc. para sequenciar a segunda base.

O ciclo de sequência pode ser repetido várias vezes. Em teoria, isso pode ser repetido até que a relação sinal-ruído seja tão baixa que o sinal base não possa ser reconhecido de forma eficaz. Como a eficiência luminosa do grupo fluorescente continua a diminuir e a atividade da enzima Taq também está a diminuir continuamente, o número de ciclos de sequenciamento é realmente limitado e o grande número de repetições está associado à formulação do reagente sbs. O número de ciclos de sequenciamento pode ser artificial durante a configuração do software, e esse número de repetições é o comprimento de leitura de cada segmento de sequenciamento. Atualmente, o comprimento de leitura da plataforma Illumina é de 2x100 bp, 2x125 bp, 2x150 bp, 2x300 bp e muitos outros, dos quais 2x150 bp é mais amplamente usado.

Sequenciamento de uma única extremidade: Sequenciamento de uma única extremidade (Single-read) primeiro fragmenta a amostra de DNA para formar um fragmento de 200-500bp, a sequência inicial é ligada a uma extremidade do fragmento de DNA e, em seguida, a extremidade é adicionada a junção para fixar o fragmento na célula de fluxo para gerar um cluster de DNA.

Sequenciamento de duas extremidades: o método de sequenciamento de duas extremidades (Paired-end) refere-se à adição de locais de ligação do precursor de sequenciamento em ambas as extremidades na construção da biblioteca de DNA a serem testados, após a conclusão do sequenciamento da roda, remover a cadeia de modelos de sequenciamento da roda, usar o módulo de sequenciamento de leitura parelhada (Paired-End Module) para orientar a regeneração e amplificação da cadeia complementar no local original para alcançar a quantidade de modelos usados ​​para o sequenciamento da segunda roda e realizar a sequenciação sintética da segunda roda da cadeia complementar.

Uma biblioteca de genoma é uma coleção formada ao cortar todo o DNA do genoma de um organismo em fragmentos de DNA de um determinado comprimento clonados em um determinado veículo. As bibliotecas de genomas são divididas em bibliotecas de genomas nucleares, bibliotecas de genomas de clorofitos e bibliotecas de genomas mitocondriais, de acordo com a origem do DNA. O doador de informações genéticas no momento em que a biblioteca genômica foi construída é o DNA genômico, portanto, sem período de desenvolvimento ou especificidade de órgão tecido, contendo clones de todas as sequências de regiões codificantes e não codificantes do DNA genômico em uma biblioteca genômica *; Cada gene de um organismo biológico tem seu próprio clone na biblioteca, que inclui sequências de intervalos em seus fragmentos genéticos, para que a biblioteca do genoma mostre realmente toda a informação estrutural do genoma.

Biblioteca Genômica: armazena toda a informação genética de um genoma biológico através de um veículo clonal em uma população de clones receptores, que é a biblioteca genômica desse organismo.

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