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Endereço
Nova área de Pudong, Xangai
Categorias do produto
Xangai Beibo Biotecnologia Co., Ltd.
Kit de teste de apoptose Apoptose Annexin V
NegociávelAtualização em05/06
- Modelo
- Natureza do fabricante
- Produtores
- Categoria do produto
- Local de origem
Visão geral
O kit de teste de apoptose Annexin V-APC é uma proteína ligadora de fosfolípidos dependente de Ca2+ com um peso molecular de 35-36 kD, que se liga específicamente à alta afinidade PS que se reverte para fora da membrana durante a apoptose. A extrapolação do PS ocorre antes da ruptura do núcleo celular, fragmentação do DNA e aparição de proteínas relacionadas à apoptose, o que torna a ligação da Annexina V ao PS precoce na apoptose. .....
Detalhes do produto
Anexina VIntrodução ao kit de teste
Temperatura de conservação:2-8 ℃ Proteção contra a luz
Anexina VKit de testePrecauções
Não pode ser conservado a -20 ° C a longo prazo.
A cromatização Annexin V-APC evita o congelamento repetido. Várias congelações podem resultar em falhas.
3.A coloração de Annexin V-APC pode ser conservada a -20 ° C após uma pequena partilha de acordo com as condições de uso quando for necessária a conservação a longo prazo.
Por favor, use o reagente o mais rápido possível após o desmantelamento!
A cromatização Annexin V-APC evita o congelamento repetido. Várias congelações podem resultar em falhas.
3.A coloração de Annexin V-APC pode ser conservada a -20 ° C após uma pequena partilha de acordo com as condições de uso quando for necessária a conservação a longo prazo.
Por favor, use o reagente o mais rápido possível após o desmantelamento!
Período de validade
1 ano
Método de teste
1. Celulômetro de fluxo
2. Foco do laser
3. Microscópio fluorescente
2. Foco do laser
3. Microscópio fluorescente
amostra aplicável
1- Células suspensas
2. Células de parede
2. Células de parede
Características do produto
1. conveniente: detecção por citométrio de fluxo ou microscópio fluorescente disponível;
Rápido: o experimento pode ser concluído em 1 hora;
Exatidão: distinguir com precisão entre células vivas, apoptosis e necrosis e contar a proporção de cada grupo de células.
Rápido: o experimento pode ser concluído em 1 hora;
Exatidão: distinguir com precisão entre células vivas, apoptosis e necrosis e contar a proporção de cada grupo de células.
Aplicações do produto
1. Celulômetro de fluxo
2. Foco do laser
3. Microscópio fluorescente
2. Foco do laser
3. Microscópio fluorescente
Preparação do instrumento
1. citométria de fluxo ou microscópio fluorescente ou co-foco a laser
2. Centrífugas
3. Pipeta
4. Frigorífico
5. caixa de gelo
2. Centrífugas
3. Pipeta
4. Frigorífico
5. caixa de gelo
Preparação do Reagente
1.PBS tampão (pH 7.4, solução salina tampão de ácido fosfórico de 10 mM comumente usada em laboratório (1X))
Solução salina equilibrada de Hank (HBSS)
Solução salina equilibrada de Hank (HBSS)
Preparação de Consumíveis
1. Tubo centrífugo
2. Sucção da cabeça
3. Luvas de uso único
4. Folha de alumínio
2. Sucção da cabeça
3. Luvas de uso único
4. Folha de alumínio
Anexina VKit de testePrecauções de uso
1. o tubo de microrreactivo da tampa de espiral deve ser brevemente centrifugado antes de abrir a tampa, coletar o líquido na parede interna da tampa para o fundo do tubo, para evitar que a perda de líquido durante a abertura da tampa cause que a dose de reagente seja insuficiente.
O tratamento celular requer cuidado para evitar danos celulares artificiais. A força centrífuga é tão pequena quanto possível sem perda de células, e a ressuspensão das células é um movimento suave, evitando múltiplos e repetidos golpes intensos. Sem osciladores turbulentos.
3.Annexin V-FITC (etc.) e iodeto de propídio (etc.) são substâncias sensíveis à luz, durante a operação, observe evitar a luz para minimizar o tempo em que estão expostos à luz. Se necessário, você pode usar caixas de gelo com tampa ou papel de alumínio para proteger a luz. As células são mantidas em um ambiente protegido da luz após a marcação. A exposição curta à luz (<30 segundos) durante a pipeta é aceitável.
Como a apoptose é um processo rápido e dinâmico, a análise é realizada imediatamente após a coloração.
O tratamento celular requer cuidado para evitar danos celulares artificiais. A força centrífuga é tão pequena quanto possível sem perda de células, e a ressuspensão das células é um movimento suave, evitando múltiplos e repetidos golpes intensos. Sem osciladores turbulentos.
3.Annexin V-FITC (etc.) e iodeto de propídio (etc.) são substâncias sensíveis à luz, durante a operação, observe evitar a luz para minimizar o tempo em que estão expostos à luz. Se necessário, você pode usar caixas de gelo com tampa ou papel de alumínio para proteger a luz. As células são mantidas em um ambiente protegido da luz após a marcação. A exposição curta à luz (<30 segundos) durante a pipeta é aceitável.
Como a apoptose é um processo rápido e dinâmico, a análise é realizada imediatamente após a coloração.
A apoptose deve ser detectada usando o kit Annexin V-FITC (etc.) para as células vivas. Não fixar as células, a operação de fixação interferirá com o resultado.
Uso
Coloração da amostra:
1. Coleta centrífuga de células suspensas. Centrífuga 300 x g -500 x g força, 2-8 ° C, tempo de centrifugação de 5 minutos, descartar o meio de cultura.
Lave as células duas vezes com PBS frio. (300 x g -400 x g, 2-8 ° C, tempo de centrifugação de 5 minutos para coletar células).
Suspender as células com 100 μl de 1X Annexin V ligação líquida em uma concentração de aproximadamente 1-5 x 106 células / ml.
Adicione 5 μl de coloração Annexin V-APC à suspensão celular e incube durante 5-15 minutos a 2-8 ° C, depois de misturar suavemente.
Após a adição de PI (ou 7-AAD) líquido de coração, misturar suavemente e incubar durante 1-3 minutos a 2-8 ° C em condições de proteção contra a luz. (Esta etapa é selecionada, de acordo com as necessidades experimentais, você pode fazer apenas a tintura APC).
Adicione 400 μl de PBS ou 1X Annexin V e misture suavemente.
7. Detectar imediatamente com citometria de fluxo.
Análise por citometria de fluxo:
As células tratadas podem ser analisadas neste momento em um citometro de fluxo.
Siga a operação de detecção de apoptose de fluxo convencional.
O comprimento de onda de excitação fluorescente da Annexin V-APC é de 652 m e o comprimento de onda de emissão é de 670 m; o comprimento de onda de excitação fluorescente PI é de 535 m e o comprimento de onda de emissão é de 620 m.
Antes do teste de embarque, é necessário preparar amostras de plasma com células a testar para definir a compensação de fluorescência do citometro de fluxo e definir a faixa de porta cruzada:
Células não infectadas com marcadores como GFP
Tubo vazio: células do grupo de controle negativo, sem células manchadas. Sem anexina V/APC, PI. Utilizado para ajustar a tensão.
Monotubular: com células apoptoticas evidentes, somente com coloração de Annexin V / APC. para a regulação da compensação.
Monotubular: as células apoptoticas são evidentes, apenas com coloração PI. Para ajustar a compensação
Tubes de teste: células tratadas a serem testadas, adicionando Annexin V / APC, PI. Após ajustar a compensação de tensão com tubos vazios e monosolares, obtém os dados de fluxo necessários.
(II) Transfecção de células GFP
① Tubo vazio não transfectado: células não transfectadas, células do grupo de controle negativo, sem células manchadas. Sem anexina V/APC, PI. Utilizado para ajustar a tensão.
Transfectação de tubos vazios com GFP: transfectação de células do grupo de controle com GFP, sem células manchadas. Sem anexina V/APC, PI. Para compensação
Monotubular não transfectado: células não transfectadas com apoptose evidente, somente com coloração de Annexin V / APC. para a regulação da compensação.
Monovaso não transfectado: células não transfectadas e com apoptose evidente, apenas com coloração PI. Para ajustar a compensação
Tubes de teste: células tratadas a serem testadas, adicionando Annexin V / APC, PI. Após ajustar a compensação de tensão com tubos vazios e monosolares, obtém os dados de fluxo necessários.
1. Coleta centrífuga de células suspensas. Centrífuga 300 x g -500 x g força, 2-8 ° C, tempo de centrifugação de 5 minutos, descartar o meio de cultura.
Lave as células duas vezes com PBS frio. (300 x g -400 x g, 2-8 ° C, tempo de centrifugação de 5 minutos para coletar células).
Suspender as células com 100 μl de 1X Annexin V ligação líquida em uma concentração de aproximadamente 1-5 x 106 células / ml.
Adicione 5 μl de coloração Annexin V-APC à suspensão celular e incube durante 5-15 minutos a 2-8 ° C, depois de misturar suavemente.
Após a adição de PI (ou 7-AAD) líquido de coração, misturar suavemente e incubar durante 1-3 minutos a 2-8 ° C em condições de proteção contra a luz. (Esta etapa é selecionada, de acordo com as necessidades experimentais, você pode fazer apenas a tintura APC).
Adicione 400 μl de PBS ou 1X Annexin V e misture suavemente.
7. Detectar imediatamente com citometria de fluxo.
Análise por citometria de fluxo:
As células tratadas podem ser analisadas neste momento em um citometro de fluxo.
Siga a operação de detecção de apoptose de fluxo convencional.
O comprimento de onda de excitação fluorescente da Annexin V-APC é de 652 m e o comprimento de onda de emissão é de 670 m; o comprimento de onda de excitação fluorescente PI é de 535 m e o comprimento de onda de emissão é de 620 m.
Antes do teste de embarque, é necessário preparar amostras de plasma com células a testar para definir a compensação de fluorescência do citometro de fluxo e definir a faixa de porta cruzada:
Células não infectadas com marcadores como GFP
Tubo vazio: células do grupo de controle negativo, sem células manchadas. Sem anexina V/APC, PI. Utilizado para ajustar a tensão.
Monotubular: com células apoptoticas evidentes, somente com coloração de Annexin V / APC. para a regulação da compensação.
Monotubular: as células apoptoticas são evidentes, apenas com coloração PI. Para ajustar a compensação
Tubes de teste: células tratadas a serem testadas, adicionando Annexin V / APC, PI. Após ajustar a compensação de tensão com tubos vazios e monosolares, obtém os dados de fluxo necessários.
(II) Transfecção de células GFP
① Tubo vazio não transfectado: células não transfectadas, células do grupo de controle negativo, sem células manchadas. Sem anexina V/APC, PI. Utilizado para ajustar a tensão.
Transfectação de tubos vazios com GFP: transfectação de células do grupo de controle com GFP, sem células manchadas. Sem anexina V/APC, PI. Para compensação
Monotubular não transfectado: células não transfectadas com apoptose evidente, somente com coloração de Annexin V / APC. para a regulação da compensação.
Monovaso não transfectado: células não transfectadas e com apoptose evidente, apenas com coloração PI. Para ajustar a compensação
Tubes de teste: células tratadas a serem testadas, adicionando Annexin V / APC, PI. Após ajustar a compensação de tensão com tubos vazios e monosolares, obtém os dados de fluxo necessários.
Análise de perguntas frequentes
Durante o experimento, a Annexina V não foi colorida ou com baixa taxa de positividade. As razões possíveis são as seguintes:
1. Configuração inadequada do citométrio de fluxo / microscópio para a detecção. Ajuste usando as configurações corretas do instrumento.
Determinar se o indutor do experimento pode causar apoptose. Isso pode ser excluído definindo um controle de medicamentos positivo com efeitos indutores exatos da apoptose.
As células não iniciaram a apoptose. Redeterminar o momento do início da apoptose induzida (experimento de cronograma).
O número de células é baixo. Aumentar o número de células.
5. As células de adesão são mal digeridas. A ligação da Annexina V ao PS requer íons Ca2+, o líquido de ligação contém Ca2+, a digestão do EDTA pode afetar a coloração, recomenda-se o uso sem EDTA ou lavar com PBS após a digestão.
A taxa positiva foi elevada durante o experimento. As razões possíveis são as seguintes:
1. Configuração inadequada do citométrio de fluxo / microscópio para a detecção. Ajuste usando as configurações corretas do instrumento.
As células em si são muito pobres. Os experimentos descobriram que as células de controle não induzidas pela apoptose tinham uma proporção excessiva de células duplamente positivas para AnnexinV+/PI+ após a coloração, o que poderia ter causado esse resultado porque as próprias células eram muito pobres em vitalidade. Recomenda-se que a vitalidade das células seja calculada com a coloração azul de taipão, e as células que rejeitam a coloração azul de taipão devem ser maiores de 95%. Se a vitalidade é baixa, recomenda-se a reanimação das células, geralmente as células recém-recuperadas devem ser transmitidas pelo menos três vezes antes de realizar o experimento.
1. Configuração inadequada do citométrio de fluxo / microscópio para a detecção. Ajuste usando as configurações corretas do instrumento.
Determinar se o indutor do experimento pode causar apoptose. Isso pode ser excluído definindo um controle de medicamentos positivo com efeitos indutores exatos da apoptose.
As células não iniciaram a apoptose. Redeterminar o momento do início da apoptose induzida (experimento de cronograma).
O número de células é baixo. Aumentar o número de células.
5. As células de adesão são mal digeridas. A ligação da Annexina V ao PS requer íons Ca2+, o líquido de ligação contém Ca2+, a digestão do EDTA pode afetar a coloração, recomenda-se o uso sem EDTA ou lavar com PBS após a digestão.
A taxa positiva foi elevada durante o experimento. As razões possíveis são as seguintes:
1. Configuração inadequada do citométrio de fluxo / microscópio para a detecção. Ajuste usando as configurações corretas do instrumento.
As células em si são muito pobres. Os experimentos descobriram que as células de controle não induzidas pela apoptose tinham uma proporção excessiva de células duplamente positivas para AnnexinV+/PI+ após a coloração, o que poderia ter causado esse resultado porque as próprias células eram muito pobres em vitalidade. Recomenda-se que a vitalidade das células seja calculada com a coloração azul de taipão, e as células que rejeitam a coloração azul de taipão devem ser maiores de 95%. Se a vitalidade é baixa, recomenda-se a reanimação das células, geralmente as células recém-recuperadas devem ser transmitidas pelo menos três vezes antes de realizar o experimento.
