Kit CCK-8 (proliferação celular e teste de toxicidade)

O Kit de Contagem de Células-8, abreviado como Kit CCK-8, é uma alternativa ao método MTT e é um kit de teste rápido de alta sensibilidade amplamente utilizado para proliferação celular e citotoxicidade com base em WST (sal monosódico de tetrazol solúvel em água, nome químico: 2-(2-metoxi-4-nitrofenilo)-3-(4-nitrofenilo)-5-(2,4-disulfonobenzo)-2H). Pode ser usado para triagem de medicamentos, teste de proliferação celular, teste de citotoxicidade, sensibilidade ao tumor e outros ensaios.

Instruções de uso:
Criação de curvas padrão (ao medir o número específico de células)
Primeiro, use a placa de contagem de células para contar o número de células na suspensão celular preparada e, em seguida, vacine as células.
2, proporcionalmente diluído em um gradiente de concentração celular, geralmente 3-5 gradientes de concentração celular, cada grupo de 3-6 poros compostos.
3, cultivo após a vacinação para a parede celular, em seguida, a adição de CCK-8 reagente cultivo após um certo tempo para determinar o valor de OD, produzindo uma curva padrão com o número de células como coordenadas transversais (eixo X), o valor de OD como coordenadas longitudinais (eixo Y). Esta curva padrão permite determinar o número de células em amostras desconhecidas (esta curva padrão é testada desde que as condições do experimento sejam consistentes para determinar o número de vacinações e o tempo de cultivo após a adição de CCK-8). ）

Teste de atividade celular

Vacinar uma suspensão celular em uma placa de 96 buracos (100 µL/buraco). Coloque a placa em um recipiente para pré-cultura (em 37 ° C, 5% de CO2).

Adicione 10 µL de solução de CCK-8 a cada orifício (cuidado para não gerar bolhas no orifício, eles podem afetar a leitura do valor de OD).

Incubar a placa no recipiente por 1-4 horas.

Determine a absorção de luz a 450 nm com um calibrador enzimático.

Se o valor de OD não for medido temporariamente, se você quiser medir mais tarde, você pode adicionar 10 µL de solução de HCl 0,1 M ou 1% de SDS (W / V) a cada orifício e cobrir a placa de cultura para manter a luz em temperatura ambiente. A absorção não muda durante 24 horas.

Valor agregado celular - teste de toxicidade

Configure 100 µL de suspensão celular em uma placa de 96 buracos. A placa é pré-cultivada em um recipiente por 24 horas (a 37 ° C, 5% de CO2).

Adicione 10 µL de substância a ser testada em diferentes concentrações à placa de cultura. Incubar no cultivo por um período apropriado (por exemplo, 6, 12, 24 ou 48 horas).

Adicione 10 µL de solução de CCK-8 a cada orifício (cuidado para não gerar bolhas no orifício, elas podem afetar a leitura do valor de OD). Se a substância a ser testada for oxidativa ou redutiva, o meio fresco pode ser substituído antes da adição de CCK-8 (removendo o meio e lavando as células duas vezes com o meio e adicionando um novo meio) para remover o efeito do medicamento.

Incubar a placa no recipiente por 1-4 horas.

Determine a absorção a 450 nm com um calibrador enzimático.

Se o valor de OD não for medido temporariamente, se você quiser medir mais tarde, você pode adicionar 10 µL de solução de HCl 0,1 M ou 1% de SDS (W / V) a cada orifício e cobrir a placa de cultura para manter a luz em temperatura ambiente. A absorção não muda durante 24 horas.

Cálculo de vitalidade:.

Vitalidade celular (%) = [A (dose) -A (em branco)] / [A (dose 0) -A (em branco)] x 100

A (administração): absorção de orifícios com células, soluções de CCK-8 e soluções farmacêuticas

A (vazio): absorção de orifícios com meio de cultura e solução de CCK-8 sem células

A (0 dose): absorção de orifícios com células, solução de CCK-8 e sem solução farmacêutica

Vitalidade celular: proliferação celular ou vitalidade citotóxica

Atenção:

① Recomenda-se fazer alguns buracos para explorar o número de células vacinadas e o tempo de cultivo após a adição do reagente CCK-8.

Os glóbulos brancos podem precisar de cultivo por mais tempo.

Quando uma placa de 96 buracos padrão é usada, a quantidade mínima de vacinação de células de parede é de pelo menos 1.000 unidades/buraco (100 µL de meio de cultura). A sensibilidade ao teste de glóbulos brancos é relativamente baixa e, portanto, a dose de vacinação recomendada não é inferior a 2.500 unidades/poço (100 µL de meio de cultura). Se você quiser usar uma placa de 24 ou uma placa de 6 poços, primeiro calcule a quantidade de vacinação correspondente por poço e adicione a solução de CCK-8 em 10% do volume total do meio por poço.

Se não houver um filtro de 450 nm, você pode usar um filtro de absorção entre 430 e 490 nm, mas 450 nm é a maior sensibilidade de detecção.

A absorção do fenol vermelho no meio de cultura pode ser eliminada ao calcular, deduzindo a absorção do fundo no buraco em branco, portanto, não afeta a detecção.