Teste híbrido in situ

NegociávelAtualização em05/06

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Visão geral

O princípio básico da detecção de híbridos in situ é o uso de uma sequência de bases complementares entre cadeias únicas de moléculas de ácidos nucleicos, com os ácidos nucleicos estrangeiros radioativos ou não radioativos (ou seja, a sonda) emparelhados com o DNA ou o RNA a ser testado no tecido, célula ou cromossomo, combinados em moléculas híbridas de ácidos nucleicos específicas, com certos meios de detecção para mostrar a localização do ácido nucleico a ser testado no tecido, célula ou cromossomo.

Detalhes do produto

Métodos e passos do experimento FISH

Um. Deformação da sonda

A sonda é aquecida em um banho de água termostática de 75 ° C por 5 minutos, colocando imediatamente a 0 ° C, 5 a 10 minutos, para que a sonda de DNA de dupla cadeia se deforme.

Dois. Alteração da espécime

① Preparar as amostras de 5-8um em um recipiente de cultivo de 50oC para 2-3h. (As amostras tingidas por Giemsa devem ser pré-decoloradas no líquido fixo e depois assadas).

② Remova a amostra do slide e mergulhe-a em um líquido de deformação de 70% de formalimida / 2 x SSC com fração de volume de 70 a 75oC por 2 a 3 minutos.

3 Desidrate imediatamente, em sequência, a espécime através da fração de volume de 70%, a fração de volume de 90% e a fração de volume de 100% da série de etanol de gelo por 5 minutos a cada vez e, em seguida, seca ao ar.

Três. híbrido

Coloque uma sonda de DNA degenerada ou pré-inflamada de 10 μL em uma amostra de diapositiva degenerada e desidratada, cubra uma diapositiva de 18 x 18, use uma capa de Parafilm e coloque-a em uma caixa escura úmida a 37 ° C durante a noite (cerca de 15 a 17 h). Como há menos líquido híbrido e a temperatura de híbrido é alta e dura muito tempo, o processo é realizado em uma caixa úmida para manter o estado úmido da amostra.

Quatro. Limpeza

Esta etapa ajuda a remover a sonda de ligação não específica, reduzindo assim o fundo.

(1) No dia seguinte à hibridação, a amostra é retirada da caixa de 37oC e a lâmina da tampa é removida suavemente.

(2) Coloque as amostras de lâminas cruzadas em uma fração de volume de 50% de formalimida/2 x SSC pré-aquecida de 42 a 50 oC e lave 3 vezes por 5 minutos cada vez.

(3) Lave 3 vezes em 1 x SSC pré-aquecido de 42 a 50 ° C por 5 minutos cada vez.

(4) A temperatura ambiente, lave levemente a amostra em 2 x SSC.

(5) Retire o vidro e seco naturalmente.

(6) Tome 200 μL de solução de duplicação (PI / antifade ou DAPI / antifade) e coloque gotas na amostra do slide e cubra o slide.

Cinco. Microscópio fluorescente para observar os resultados do FISH

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