Kit de ELISA de Interfena 1β (IL-1β) em ratos

1.Tipo de amostra e coleta:

O soro：As amostras de sangue inteiro coletadas no tubo de separação de soro são colocadas a temperatura ambiente.0.5-2horas ou4℃Passar a noite e depois1000×gCentrífuga20 minutos, remova-o ou coloque-o no-20℃ou-80℃Conservar, mas evitar congelamento repetido.
Plasma sanguíneo：UsarEDTAou hepatina como anticoagulante para coletar a amostra e colocar a amostra após a coleta30Dentro de minutos2-8℃ 1000×gCentrífuga15minutos, remover a limpeza pode ser detectado, ou colocar a limpeza superior em-20℃ou-80℃Conservar, mas evitar congelamento repetido.

Organização homogênea:Usar pré-frioPBS (0,01M, pH=7,4)Enxague o tecido, remova o sangue residual (os glóbulos vermelhos fissados na homoplasma afetarão os resultados da medição), depois de pesar o tecido será cortado com o volume correspondentePBS(Pressão geral1:9proporção de peso, por exemplo,1 gramostra de tecido correspondente9 mldePBSO volume específico pode ser adequadamente ajustado e registrado de acordo com as necessidades experimentais. Recomendado emPBSAdicionar inibidores de protease) adicionar ao homogêmero de vidro e moer completamente no gelo. Para separar ainda mais as células do tecido, o molho homogêneo pode ser quebrado por ultra-som ou congelado repetidamente. Finalmente, a solução será uniforme5000×gCentrífuga5~10minutos,Remover limpo pode ser detectado,Ou colocar em cima-20C ou-80Conservar a temperatura, mas evitar o congelamento repetido。

Liquido de fissão celular: Eliminar o líquido de cultura, usandoPBS (0,01 M, pH 7,4) lava as células novamente. Rasgar as células com as células e adicionar 2-5 mL de PBS (0,01 M, pH 7,4). As células suspensas podem ser omitidas. Recolha a suspensão celular, centrífuga a 4 ° C 1000 x g por 10 min, descarte o meio de cultura e lavá-lo 3 vezes com PBS pré-refrigerado. Adicionar uma quantidade apropriada de PBS pré-refrigerado ou lisado de células não degeneradas (adição de inibidores de protease antes da administração) para a ressuspensão das células, geralmente uma placa de 6 buracos por um buraco de volume celular requer 150-250 μL de PBS ressuspensão. Coloque a amostra em -20 ° C ou -80 ° C para que a amostra congele, deixe a amostra descongelada a temperatura ambiente, congele repetidamente 3 vezes para que as células se desintegram completamente, e a amostra também pode ser quebrada por ultra-som para alcançar o objetivo da desintegração. 4 ℃ 10.000 x g centrífuga 10min, remover os fragmentos celulares, remover claramente detectável,Ou colocar em cima-20C ou-80Conservar a temperatura, mas evitar o congelamento repetido。

Culturas celulares ou outras amostras biológicas:por favor1000×gCentrífuga20minutos, remover a limpeza pode ser detectado, ou colocar a limpeza superior em-20C ou-80Conservar a temperatura ℃, mas deve ser evitado congelamento repetido.

2.Conservação e estabilidade da amostra

A amostra está2-8℃Em condições que possam ser armazenadas72h， Em- 20℃ou-80℃Pode ser armazenado6 meses eacimaApós a coleta da amostra, não uma única detecção, por favor, congele por uma única dose para evitar o congelamento repetido.

Passos:

1. Número: a amostra corresponde ao número de microporos em sequência, cada placa deve definir um controle negativo2 buracos, 2 buracos de controle positivo, 1 buraco de controle em branco (buraco de controle em branco sem amostras e reagentes de marcação enzimática, todas as etapas restantes são idênticas)）。

2. Amostragem: Adicionar controle negativo e controle positivo nos orifícios de controle yin e positivo, respectivamente50μl。 Em seguida, adicione 40 μl de diluição da amostra no orifício da amostra a ser testada e, em seguida, adicione 10 μl da amostra a ser testada. Coloque a amostra no fundo do orificio da placa de marcação enzimática, tente não tocar a parede do orificio e agite suavemente.

3. Criação térmica: placa de membrana de vedação para trás37Temperatura 3°C0minuto。

4. Distribuição: seráDepois de diluir 30 vezes o líquido de lavagem concentrado com água destilada.

5. Lavagem: remover cuidadosamente a membrana de vedação e descartar o líquido,Deixa-te secar.encher cada buraco com líquido de lavagem, colocarDepois de 30 segundos, descarte e repita 5 vezes.

6. Adição de enzimas: Adição de reagentes enzimáticos a cada poço50μl， Exceto os buracos em branco。

7. Criação térmica: placa de membrana de vedação para trás37Temperatura 3°C0minuto。

8. Lavagem: remover cuidadosamente a membrana de vedação e descartar o líquido,Deixa-te secar.encher cada buraco com líquido de lavagem, colocarDepois de 30 segundos, descarte e repita 5 vezes.

9. Colorização: adicione primeiro o agente de coloração a cada buracoA50μlAdicione mais um colorante.B50μlsuavemente misturado,37Temperatura de iluminação 10-20Um minuto.

10.Terminação: Terminação por furolíquido50 μlTerminar a reação.(O azul passa a amarelo)。

11.Determinação: Zero com buraco em branco,450nmO comprimento de onda mede cada buraco em sequência.Absorber a luzgrau (ODvalor). A medição deve ser feita após a adição do líquido final15Realizado em minutos.

Atenção:

1. Preparação do reagente: o kit deve ser retirado do ambiente refrigerado em equilíbrio a temperatura ambientePode ser usado após 15-30 minutos. As marcas enzimáticas necessárias para preparar um experimento podem ser removidas da placa microporosa, seladas e armazenadas de acordo com as instruções para uso próximo.

2. Amostragem: Use uma sucção de esterilização única durante a operação experimental para evitar a poluição. Tenha cuidado ao fazer a amostra para que não haja bolhas, coloque a amostra no fundo da placa de marcação enzimática, tente não tocar a parede do buraco, agite suavemente e misture. Assim como com a adição de reagentes de reação, o intervalo de amostragem entre o primeiro buraco e o último buraco durante o processo de amostragem é o menor possível (geralmente controlado emMenos de 10 minutos), se for muito grande, levará a diferentes tempos de "pré-temperação", afetando claramente a precisão e a repetibilidade das medições. Para a precisão da medição, recomenda-se a configuração de poros compostos para experimentos.

3. Criação térmica: para evitar a evaporação da amostra, durante o experimento, coloque a placa enzimática com tampa ou revestimento em uma caixa úmida para evitar a evaporação do líquido, a placa deve ser lavada o mais rápido possível após a próxima operação, a placa enzimática deve ser evitada em qualquer momento no estado seco, ao mesmo tempo, deve ser estritamente seguido pelo tempo e temperatura de criação térmica dados.

4. Lavagem:Liquido de lavagem concentradopossívelVai haver.CristalizaçãoDeposito, diluído pode ser aquecido em banho de águaA lavagem não afeta o resultado. A lavagem adequada é muito importante e o líquido de lavagem * deve ser secado durante cada lavagem. Durante o processo de lavagem, o líquido de lavagem residual no buraco de reação deve ser secado no papel de absorção de água, não coloque o papel de absorção de água diretamente no buraco de reação para absorver água, ao mesmo tempo, apague suavemente o líquido residual e as impressões digitais no fundo da placa para evitar afetar a leitura final do calibre enzimático. Se você usar uma máquina de lavar placas automática, use-a depois de usar com habilidade durante o processo experimental formal.

5. Controle do tempo de reação: após a adição do substrato, observe regularmente a mudança de cor do buraco de reação, se observar uma cor mais escura, adicione o líquido terminante com antecedência para terminar a reação, para evitar a reação excessiva e afetar a leitura da densidade óptica do calibre enzimático.

6. Substrato: Mantenha o substrato longe da luz para evitar a exposição direta à luz intensa durante o armazenamento e a criação térmica.