Recentemente, a equipe do professor Wu Runlong da Universidade de Ciências da Informação de Pequim, juntamente com a equipe do professor Shao Shumin da Universidade de Técnica de Harbin, a equipe do professor adjunto Wang Aimin da Universidade de Pequim e a equipe do professor Feng Lishuang da Universidade Aeroespacial de Pequim, desenvolveram com sucesso a segunda geração de microscópio bifotônico de microscópio bifotônico de microscópio de microscópio de microscópio de microscópio de microscópio de microscópio de microscópio de microscópio de microscópio de microscópio de microscópio Os resultados mostram que a ultralente não é mais apenas um conceito de laboratório, mas já é capaz de suportar imagens funcionais do cérebro de alta qualidade e em condições comportamentais naturais dos animais, ajudando o desenvolvimento de imagens biomédicas. O artigo de pesquisa "Microscópio em miniatura de dois fotões baseado em metais compostos para imagem de grandes FOV em animais livremente comportamentais" foi publicado online na PhotoniX (fator de impacto médio de 5 anos 19,3).

Captura de tela do artigo

O microscópio bifotônico miniaturizado tornou-se uma ferramenta importante para analisar a atividade dos neurônios cerebrais animais em estados de comportamento livre. Atualmente, o microscópio bifotônico miniaturizado de alto desempenho alcançou uma alta resolução espacial-temporal, um grande campo de visão e imagens multicoloridas.^[1-3]No entanto, os microscópios bifotônicos miniaturizados de alto desempenho já existentes ainda enfrentam o desafio de "peixe e palma de urso não podem ser combinados" - dificuldades para equilibrar o alto desempenho de imagem com a maior leveza da sonda: geralmente pesam mais de 2g (como o FHIRM-TPM pesa 2,15g).^[1]O FHIRM-TPM 2.0 重2.45g^[2]O FHIRM-TPM 3.0 重2.6g^[3]、 UCLA 2P Miniscope pesa cerca de 4g^[4]Portanto, é difícil aplicar-se a observações multicerebrais em pequenos animais sensíveis ao peso, como pássaros cantores, morcegos, ratos e pequenos animais.

A tecnologia de ultralentes oferece a possibilidade de romper esse gargalo, oferecendo novas ideias para sistemas ópticos de microscópio miniaturizados com vantagens como ultra-fina, abertura numérica elevada e design flexível, como correção de desvios. Mas o microscópio bifotônico em miniatura, baseado em um projeto de superlente única, era difícil de resolver o problema do campo de visão limitado e da imagem externa do eixo, limitando muito sua aplicação prática.

A equipe do projeto projetou uma arquitetura de super lente composta para "imagem secundária" (Figuras 1a, b) que desacopla a função de varredura e foco, rompendo a cadeia de equilíbrio entre o peso, o campo de visão e a resolução da arquitetura de imagem miniaturizada tradicional, oferecendo novos métodos para a imagem multicerebral de animais livremente ativos.

Figura 1 Estrutura e projeto do Meta-m2PM 2.0: (a) Esquema da arquitetura de lentes superestruturais compostas para implementar um sistema de imagem de dois estágios. D é o diâmetro do feixe laser de entrada; MEMS é um sistema micromecânico; FOVimage focaliza o campo de visão no plano; fscan é a distância focal da lente de varredura; α é o ângulo de inclinação do MEMS; θ é o ângulo de varredura de dois eixos MEMS. b) Forma e trajetório do componente da sonda Meta-m2PM 2.0. HC-920 é uma fibra óptica de núcleo de ar para transmissão de 920 nm; SFB para feixe de fibra óptica flexível

A equipe conjunta projetou ainda uma alta proporção de profundidade e largura Si insensível à polarização aplicada a fótons duplos₃N₄A biblioteca de células, projetada em colaboração com uma lente de super-lente de dupla camada e um espelho de varredura de ultra-lente de grande ângulo (Figura 2a, b), alcançou a otimização de banda dupla de luz excitada de 920nm com coleta de fluorescência de 500-560nm, reduzindo o peso da lente para um décimo do peso da lente miniaturizada tradicional, com o peso da sonda de apenas 1,06g (Figura 2c, d). Nova geração de microscópios bifotônicos miniaturizados com superlentes compostas: campo de visão expandido para 350 x 330 µm²mais de 50 vezes superior à primeira geração; Resolução horizontal central de 1,17 µm, mantendo uma resolução superior a 80% mesmo na borda do campo de visão; Além disso, a equipe capturou claramente imagens de atividade prolongada da estrutura axional fina e neurônicos em ratos vivos a uma profundidade de 210 µm (Figura 2e).

Figura 2 Preparação de ultralentes com teste de desempenho da sonda: (a) Esquema de células individuais. H é a altura (1.500 nm); L é o comprimento (90-350 nm); P é o período (400 nm). b) Imagens de microscópio eletrônico de varredura de lentes superestruturadas preparadas: i) Visão positiva; ii) Área central; iii) Áreas periféricas. (c) Fotografias de objetivos ultralentes (MO, peso 0,05 g) e FHIRM-TPM 3.0-U (3,0-U, peso 0,5 g). (d) Fotos do componente da sonda Meta-m2PM 2.0. (e) Figura esquerda: imagem estrutural da córtex M1 de ratos transgênicos Thy1-YFPH fixados na cabeça a uma profundidade de 154 μm. Imagem à direita: Imagem de cálcio de neurônios corticais M1 de camundongos que expressam GCaMP6f a uma profundidade de 210 μm

Em um experimento de imagem cerebral de ratos de comportamento livre, a equipe acompanhou de forma estável a atividade de cálcio de mais de centenas de neurônios, alcançando uma relação de sinal-ruído de 7,6 e rastreando o mesmo lote de neurônios a longo prazo (Figura 3a-c). Graças ao design da sonda ultra-leve de 1,06 g, o efeito inercial do Meta-m2PM 2.0 é significativamente reduzido e a estabilidade melhorada em comparação com os microscópios bifotônicos miniaturizados anteriores: 90% do deslocamento do campo de visão é inferior a 5 µm em testes de estabilidade de curto prazo e não excede 10 µm em observações de longo prazo ao longo do dia (Figura 3d, e).

Figura 3 Imagem de cálcio aplicada a ratos livremente ativos Meta-m2PM 2.0: (a) esquerda: foto de ratos usando Meta-m2PM 2.0; Direita: 12 minutos de trajetória de movimento do rato. (b) esquerda: imagem de profundidade de 190μm na córtex M1 em ratos livremente ativos; Direita: Divisão de 122 neurônios. (c) Relação de sinal-ruído (SNR) do cálcio dos neurônios durante o registro de 12 minutos. (d) O mesmo campo de visão da córtex M1 foi imagenado durante dias diferentes, com círculos marcando partes dos mesmos neurônios que foram reconhecidas repetidamente em diferentes experimentos. e) Estabilidade a curto e longo prazo da imagem. Esquerda: Análise de estabilidade de curto prazo do deslocamento do campo de visão na direção x e y em oito experimentos realizados em três ratos em condições de exploração livre de campo aberto (cada vez > 600s); Direita: deslocamento de campo de visão a longo prazo correspondente ao experimento em (d)

Os resultados do estudo, através da integração profunda da tecnologia de ultralentes compostas com a tecnologia de microimagem bifótonica miniaturizada, conseguiram avanços em ultra-peso, grande campo de visão, córtex profundo e alta resolução. A tecnologia de ultra-lente é ainda mais prática para realizar pela primeira vez a imagem funcional do cérebro animal com microscópio bifotônico de microlente.

No futuro, a pesquisa em tecnologia de ultralentes será ampliada ainda mais para a análise de redes neuronais, como imagens multicoloridas de comportamento livre, observações sincronizadas de áreas múltiplas do cérebro, estudos de espécies (morcegos, aves, roedores jovens), e espera-se que desempenhe um papel importante nas áreas da análise dos princípios cognitivos do cérebro, diagnóstico precoce de doenças cerebrais e avaliação de medicamentos neurológicos.

O primeiro autor do artigo é Zhang Yao, Hao Zheyu, da Universidade Aeroespacial de Pequim e da Universidade de Tecnologia da Informação de Pequim, e da Universidade Técnica de Harbin (Shenzhen); Os co-autores da comunicação são o professor Wu Runlong, da Universidade de Ciências da Informação de Pequim, o professor Shao Shukmin, da Universidade Técnica de Harbin e o professor associado Wang Aimin, da Universidade de Pequim. O professor Wu Runlong é responsável pela concepção geral do projeto de pesquisa e lidera o projeto e a construção do sistema óptico principal; Prof. Xu Shumin orienta o projeto e otimização de super lentes; O professor Wang Aimin forneceu apoio técnico essencial para os experimentos de bioimagem. O projeto recebeu apoio financeiro do grande projeto 2030 “Ciência do Cerebro e Pesquisa Cerebroide”, do Laboratório de Imagens Biomédicas de Pequim, do Fundo Nacional de Ciências Naturais, do Fundo de Ciências Naturais da Cidade de Pequim e do Projeto de Pesquisa Básica da Cidade de Shenzhen.

Hao, Z., Zhang, Y., Zhu, Y. et al. Microscópio de dois fotões em miniatura baseado em metalens compostos para imagens de grande FOV em animais livremente se comportando. PhotoniX 6, 57 (2025).https://doi.org/10.1186/s43074-025-00218-y

[Referência]

1. Zong W, Wu R, Li M, Hu Y, Li Y, Li J, et al. Microscopia de dois fotões em miniatura rápida de alta resolução para imagens cerebrais em ratos que se comportam livremente. Métodos Nat. 2017; 14(7):713–9.

2. Zong W, Wu R, Chen S, Wu J, Wang H, Zhao Z, et al. Microscopia de dois fotões em miniatura para o campo de visão ampliado, imagens cerebrais de planos múltiplos e de longo prazo. Métodos Nat. 2021; 18(1):46–9.

3. Wu R, Zhao C, Qiu S, Zhu Y, Zhang L, Fu Q, et al. Um microscópio de dois fotões em miniatura versátil que permite a imagem multicolorida do cérebro profundo. Métodos Nat. 2025; 22:1935-1943.

4. Madruga BA, Dorian CC, Yang L, Sehgal M, Silva AJ, Shtrahman M, et al. Sistemas de microscopia em miniatura de 2 fotões de alto desempenho de código aberto para animais que se comportam livremente. Comuna Nat. 2025; 16(1):7125.