Para resolver esse problema, a equipe de desenvolvimento projetou uma plataforma de imagem de fluorescência multimodal que integra o sistema de navegação de fluorescência de campo amplo (WF-Nav) com microimagem de bifotões miniaturizada e microimagem de trifotões miniaturizada. Para tirar o máximo proveito da excitação de fotões únicos, o sistema WF-Nav é equipado com um grande campo de visão e resolução de célula única para identificar rapidamente áreas de interesse específicas. Uma vez localizado na área alvo, o sistema pode mudar sem problemas para imagens de dois ou três fotões para obter ainda mais alta relação sinal-ruído ou imagens neurônicas profundas. Em seguida, a sonda m2PM ou m3PM foi fixada na cabeça do rato, liberando o rato para imagens de atividade livre.

Figura 1. Desenho do sistema de imagem fluorescente multimodal

O sistema WF-Nav é composto por um microscópio de campo amplo multicolorido e um adaptador multifuncional. O sistema usa três LEDs como fonte de luz de excitação (405nm, 473nm, 561nm) e é equipado com lentes de foco não esféricas com um alto abertura numérica para alinhar o feixe LED, com cada caminho de luz de excitação equipado com o conjunto de filtros correspondente. Para permitir a navegação de grandes campos de visão e oferecer espaço suficiente para uma comutação perfeita de conjuntos de espelhos multifotônicos, a equipe de desenvolvimento projetou uma lente seca com baixa magnificação e longas distâncias de trabalho. O objetivo (3,3x) tem um design anti-telemóvel: o grupo frontal fornece uma focalidade de luz negativa para duas lentes duplas coladas e o grupo posterior é composto por uma única lente esférica. Essa estrutura moveu o plano principal para trás para corrigir a diferença de cor, alcançando uma distância de trabalho de foco eficaz ultra-longa, mantendo o abertura numérica, e finalmente alcançando um indicador inovador de distância de trabalho de 90 mm e alcançando o campo de imagem máximo de Φ5,64 mm.

Figura 2. Projeto de microscópio fluorescente de campo amplo

Para permitir uma mudança perfeita entre o modo de campo amplo e o modo de imagem multifotônica, a equipe projetou um adaptador multifuncional. O adaptador conecta a lente de campo amplo e ajusta a distância focal na plataforma elétrica do eixo Z. Através do design padronizado da sonda m2/3PM, a sonda pode ser montada firmemente no mesmo suporte e garante imagens de foco simultâneo quando se muda o modo de múltiplos fotões e de campo amplo.

Figura 3. Adaptador multifuncional e função de zoom

Esta lente com uma distância de trabalho de 90 mm oferece espaço suficiente para operar o elemento, a fibra óptica ou o módulo de lente de zoom elétrico desmontável. O suporte do elemento é montado em uma trilha de esferas lineares leves com uma resistência de deslizamento mínima (cerca de 0,1 N) e uma distância de deslizamento de 12 mm, evitando eficazmente o risco de colisão entre o objeto e a amostra. Ao substituir o suporte de cabeça, o sistema é compatível com diferentes cabeças, como o mini2P e o m3PM. Além disso, graças ao tamanho do microscópio bifotônico miniaturizado e ao design retrátil, o sistema oferece um ângulo de observação maior na maioria das direções em comparação com os objetivos de mesa convencionais, o que resulta em uma amostra mais ampla. Este design melhora significativamente a eficiência de localização grosseira da amostra.

Figura 4. Comparação entre diferentes objetivos e ângulos de observação do microscópio bifotônico miniaturizado

Em seguida, os desenvolvedores avaliaram o desempenho óptico e a aplicação prática do microscópio de fluorescência de campo amplo. Imagens de cortes cerebrais de ratos Thy1-YFPH permitem identificar claramente neurônios e axões. A imagem de íons de cálcio vivos a um comprimento de onda de 470 nm e a imagem morfológica a um comprimento de onda de 561 nm capturaram com sucesso 3.804 neurônios marcados por GCaMP6f e 4.650 astrócitos de rato que expressam mCherry. Estes resultados demonstram que o microscópio de campo amplo possui capacidade de imagem multicolorida, de resolução unicelular e de alto fluxo e oferece excelente desempenho na navegação em áreas alvo de interesse.

Vídeo 5. Microscópio de campo amplo miniaturizado de imagem de alto fluxo

Para tornar a imagem m2PM mais suave em ratos livremente ativos, os desenvolvedores criaram um conjunto de processos de imagem padronizados para melhorar a eficiência da imagem m2PM em animais livremente ativos. Inicialmente, os animais são injetados com vírus e procedimentos cirúrgicos, como um implante de janela craniana ou um implante de lente GRIN, e, em seguida, aguardem 2 a 4 semanas para garantir a expressão adequada do vírus e a recuperação da lesão cirúrgica. Tomando um experimento como exemplo, marcamos GCaMP6s e mCherry em neurônios do córtex mótor primário (M1) e, em seguida, fixamos os ratos em uma pista de corrida sob o dispositivo WF-Nav. Em seguida, posicionar a área de interesse do alvo através de um microscópio de campo amplo e alinhá-lo para o centro do campo de visão. Em seguida, mude para o modo m2PM através do adaptador para imagens bifótonicas bicolores a comprimentos de onda de 920nm e 1030nm e, finalmente, para ajustes finos no eixo XY e no plano focal, a área de alvo final pode ser confirmada em minutos. Na maioria dos casos, o nível focal alvo é elevado por cerca de 25 µm para compensar o desvio de foco causado pela contração do cimento e a placa de base é fixada na cabeça do animal e, após cerca de 10 minutos de cura, os ratos podem fazer imagens de movimento livre.

Figura 6. Processo padronizado de microimagem de microfótons duplos de atividade livre

Os desenvolvedores validaram o sistema através de imagens de sinais de cálcio e estruturas de neurônios em experimentos sociais em ratos, que levaram cerca de 20 minutos para instalar e com taxas de sucesso de até 100% (n = 15) que podem ser facilmente dominadas até mesmo por pesquisadores inexperientes, melhorando significativamente a eficiência do experimento. Além disso, imagens repetidas de vários dias de neurônios da camada 2 da região M1 e astrócitos mostraram que o alojamento de campo de visão foi estável sem a reinstalação da Baseplate.

Figura 7. Imagem do mesmo campo de visão durante vários dias

Graças ao design mecânico padronizado, a cabeça de imagem m3PM pode ser facilmente instalada no suporte. Aplique um adaptador multifuncional para uma mudança perfeita do modo de campo amplo para o modo de imagem de três fotões. Devido às limitações da profundidade da imagem com microscópio de fotão único de campo amplo, os sinais profundos tendem a ser difíceis de detectar; Embora os vasos sanguíneos superficiais possam servir como referência, manter a área de injeção do vírus na superfície pode fornecer marcadores fluorescentes mais diretos que ajudam a alinhar áreas mais profundas no eixo vertical. Os desenvolvedores registraram com sucesso a atividade neuronal da região pós-súbica a uma profundidade de até 1020 μm da superfície do córtex em ratos com cabeça fixada e expressão de GCaMP6f, e conduziram experimentos de exploração comportamental de ausência em ratos que registraram atividade de sinalização de cálcio prolongada a uma profundidade de 670 μm.

Figura 8. Imagem de comportamento fixo e livre trifotônica miniaturizada

O trabalho foi realizado pelo professor Wu Runlong, da Universidade de Ciências da Informação de Pequim (autor da comunicação), Wang Aimin, professor Cheng Heping e outros.

[Referência]

Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Sistema de navegação de fluorescência de campo amplo para imagens multifotônicas em miniatura eficientes em animais de comportamento livre. Neurofotônica. 2025; 12(2):025018. Doi:10.1117/1.NPh.12.2.025018