Na preparação da cromatografia líquida, a coluna de proteção é a primeira linha de defesa da coluna de análise principal, o seu papel é a adsorção de impurezas na amostra (como partículas, fortes componentes de retenção, interferentes da matriz, etc.) para evitar a poluição ou bloqueio da coluna principal. Como a fase líquida de preparação geralmente processa amostras de alta concentração e grande volume e a velocidade de perda da coluna de proteção é mais rápida, o método de conservação científico é essencial para prolongar sua vida útil e garantir a eficiência da separação. Aqui estão as estratégias de conservação e os pontos operacionais para preparar a coluna de proteção de fase líquida:

Função e mecanismo de perda da coluna de proteção

1. Funções principais

- interceptar partículas na amostra (por exemplo, sólidos não dissolvidos, partículas) para evitar o bloqueio da placa de filtragem da entrada da coluna principal;

- adsorber impurezas fortes de retenção (por exemplo, componentes liposolúveis, proteínas, etc.), para evitar a poluição de fase fixa da coluna principal;

- Estabilizar a fronteira da fase de fluxo, reduzindo o impacto direto da amostra com a coluna principal.

2. Causas da perda

Bloqueio físico: acumulação de partículas pequenas ou matéria colóide na amostra;

- Sobrecarga de adsorção química: altas concentrações de impurezas ultrapassam o limite de capacidade da coluna de proteção;

- Poluição biológica: resíduos de proteínas e micróbios causam uma diminuição do efeito da coluna (especialmente no sistema de fase aquática);

- Erosão em fase de fluxo: solventes incompatíveis (como ácidos / álcalis fortes) danificam a estrutura de preenchimento da coluna de proteção.

Especificações de manutenção diária

1. Preparação antes da instalação

- Confirmação da direção: a direção da seta de identificação da coluna de proteção deve ser alinhada com a direção da fase de fluxo, para evitar que a remontagem leve à perda de preenchimento;

- Inspeção de junção: Use junções de volume morto zero adaptadas ao diâmetro da coluna (por exemplo, 1/16 polegada ou 1/8 polegada) para evitar a difusão de fluxo turbulento;

- Ativação inicial: a nova coluna de proteção precisa ser equilibrada adequadamente com a fase de fluxo objetivo (velocidade de fluxo recomendada de 5-10 mL / min, volume de lavagem ≥ 30 mL), eliminando o ar do enchimento.

2. Otimização do pré-tratamento da amostra

- Desfiltração: a amostra deve ser filtrada por uma membrana de filtro de 0,22 μm para remover as partículas em suspensão;

- Clarificação centrífuga: Centrífuga de alta velocidade da amostra turbulenta (por exemplo, 10.000 rpm, 10 minutos) para extrair a amostra líquida;

- Controle de diluição: as amostras de alta concentração devem ser diluídas dentro da capacidade de adsorção da coluna de proteção para evitar sobrecarga instantânea.

3. Gestão de Fase de Fluxo

Compatibilidade do pH com o solvente: o preenchimento da coluna de proteção (como C18, SCX, etc.) deve corresponder à faixa de pH da fase de fluxo (geralmente 2-8) para evitar corrosão ácida / alcalina forte;

- Lavagem após lavagem em gradiente: se usar lavagem em gradiente, a coluna de proteção deve ser lavada após a fase de fluxo inicial ≥ 10 mL para evitar a precipitação de sal ou resíduos de substâncias hidrofóbicas;

- Gestão do sal tampão: o fluxo de sal tampão é necessário para substituir a lavagem regular com água para evitar o bloqueio do cristal do sal.

4. Monitoramento de pressão e proteção de fluxo limitado

Definição do limiar de diferença de pressão: a queda de pressão normal da coluna de proteção é geralmente de 1-3 bar (velocidade de fluxo de 10 mL / min), se a diferença de pressão subir mais de 50%, indicando o risco de bloqueio;

- Estratégia de substituição: de acordo com a complexidade da amostra, recomenda-se a substituição forçada da coluna de proteção após cada processamento de 50-100 amostras.

Recuperação e reparação da coluna de proteção

1. Recuperação química

- Lavagem inversa: para a coluna de proteção saturada de adsorção, pode ser lavada inversamente com solventes orgânicos elevados (como metanol, acetonitril), velocidade de fluxo de 5-10 mL / min, volume de lavagem ≥ 50 mL, lavagem de impurezas de adsorção enfraquecidas;

- Gradiente lavagem regeneração: para a forte retenção de impurezas, a utilização de lavagem gradiente (como o gradiente metanol-água), gradualmente aumentar a proporção orgânica, lavagem em etapas;

- Limpeza de solventes especiais: as impurezas solúveis em gordura podem ser lavadas com isopropanol ou tetrahidrofurano, a poluição de proteínas pode ser lavada com solução de água de 0,1% TFA.

2. Medios de reparação física

- Auxiliar por ultra-som: remover o preenchimento da coluna de proteção (se necessário), mergulhar no solvente durante 10-15 minutos e recarregar;

- Limpeza da placa de filtragem: remova a placa de filtragem de importação e saída, enxague com uma escova macia ou água ultra-pura para remover as partículas embutidas.

3. Verificação do efeito regenerativo

- Teste de efeito da coluna: injeção de substâncias padrão (por exemplo, benzeno, naftalênio) após a regeneração, para detectar se o número de torres retornou a mais de 80% do valor inicial;

- Linha de base de corrida vazia: lavagem com a fase de fluxo até a linha de base suave, sem picos fantasmas ou fenômenos de atraso.

Armazenamento e substituição da coluna de proteção

Suspensão de curta duração

- Conservação úmida: encher a coluna de proteção com a fase de fluxo inicial ou solução metanol-água (1: 1), vedando as duas extremidades contra secagem;

- Proteção contra a luz a baixa temperatura: a temperatura de armazenamento é recomendada de 4 a 25 ° C, para evitar que o congelamento cause danos à estrutura do preenchimento.

2. Processamento de desativação a longo prazo

- Limpeza: lavagem consecutiva com metanol, água, metanol para remover sal tampão e resíduos de matéria orgânica;

- Conservação a seco: após o soprado de nitrogênio ou a aspiração a vácuo, o selo é mantido no secador.

Alteração de critérios de julgamento

- Diferença de pressão anormal: a mesma velocidade de fluxo cai mais do que duas vezes o valor inicial;

Diminuição da separação: deslocamento de tempo de retenção do pico principal > 10% ou atraso grave em forma de pico;

- Penetração de impurezas: poluição anormal da coluna principal (por exemplo, resíduos de picos desconhecidos), excluindo outros fatores, a coluna de proteção precisa ser substituída.

Precauções e erros comuns

Evitar a “proteção excessiva”

- As colunas de proteção não são universais, e se as concentrações de impurezas da amostra são altas (por exemplo, materiais brutos), é necessário conectar várias colunas de proteção em série ou priorizar o pré-tratamento offline (por exemplo, extração de fase sólida).

2. Proibição do funcionamento do tronco

- A secagem da coluna de proteção pode causar a rachadura do preenchimento e a mudança do caminho do fluxo de água, que precisa ser sempre mantida em um estado úmido.

3. Não exceder a velocidade

A velocidade de fluxo de fase líquida de preparação é alta (geralmente 10-50 mL / min), mas a velocidade de fluxo da coluna de proteção deve corresponder estritamente ao limite superior do projeto (por exemplo, o valor da resistência à pressão do enchimento) para evitar danos mecânicos.

4. Registo de manutenção

- Registre a diferença de pressão, o solvente de lavagem, o número de regenerações e a data de substituição após cada uso para apoiar a otimização posterior.