Um,Tubo centrífugo ultrafiltradoOtimização de parâmetros de centrifugação

Velocidade e Tempo

A centrifugação inicial é recomendada a partir de 70% da velocidade de rotação recomendada (por exemplo, centrifugação de 3.000 x g por 10 minutos), após a velocidade de fluxo observada é ajustada gradualmente para 4.000 x g, mas não deve exceder o limite de tolerância da película de filtro.

O tempo de processamento típico é de 10 a 30 minutos, dependendo do peso molecular de retenção (MWCO) e do volume da amostra.

Controle de temperatura

A centrífuga precisa ser pré-arrefecida a 4 ° C para reduzir a adsorção de deformação térmica. Ambientes de baixa temperatura podem prolongar a vida útil da membrana, mas é importante notar que o tempo de concentração pode ser prolongado.

Aceleração e equilíbrio

A aceleração centrífuga é ajustada para o nível mínimo para reduzir a pressão sobre a membrana.

Certifique-se de que a qualidade do tubo de ultrafiltro emparelhado é equilibrada com a gravidade e que a posição e a orientação do elemento de filtro são consistentes para evitar oscilações ou danos durante o processo de centrifugação.

Estratégia de Aumento da Recuperação

Seleção e pré-tratamento de filtros

Escolha a membrana de ultrafiltro MWCO 2-3 vezes menor do que a molécula alvo de acordo com o peso molecular alvo. Por exemplo, quando o peso molecular da proteína alvo é de 35kDa, escolha um tubo de ultrafiltro com um peso molecular de retenção de 10kDa.

A membrana de ultrafiltro do novo tubo centrífugo ultrafiltrado contém traces de glicerina, que devem ser mergulhadas em água pura ou tampão e colocadas no frigorífico durante 10 minutos antes de serem usadas. Depois derrame água pura e coloque o tubo de ultrafiltro no gelo por 2 a 5 minutos.

Processamento e amostragem de amostras

As amostras são filtradas com antecedência com uma membrana de filtro de 0,22 μm para evitar que as partículas bloqueem a membrana de ultrafiltro.

Adicione lentamente a amostra ao tubo de ultrafiltro para que a superfície do líquido não exceda a linha máxima de marcação. A operação é leve durante a amostragem para evitar danificar a estrutura da membrana.

Concentração e eliminação

Pausa a cada 5 minutos durante o processo de centrifugação e sopra suavemente a camada de retenção com uma pistola de pipeta para evitar que as grandes moléculas se acumulem para formar camadas de polarização diferencial.

O volume de retenção é controlado em 1/10 a 1/20 do volume de amostra original. Múltiplos de concentração muito elevados podem levar à acumulação de proteínas, que podem ser substituídas pela adição de tampão no meio da ultrafiltração, concentração em etapas.

Para amostras viscosas (como glicerina ou sacarose), a velocidade de rotação deve ser reduzida em 10% a 20% e o tempo de centrifugação prolongado.

Operações de reciclagem

Após a centrifugação, as grandes moléculas permanecem na camada superior e as pequenas moléculas e o solvente passam pela membrana para a camada inferior. Filtro de tubo externo para substâncias e solventes de pequenas moléculas; O líquido interno é uma substância macromolecular.

Para coletar a matéria macromolecular, o tubo externo é retirado e o tubo interno é invertido para centrifugar 1000 x g por 1-2 minutos.

Perguntas e soluções frequentes

Proteína vazada ou não detectada

Causa: seleção inadequada do filtro, parâmetros de centrífuga inadequados, concentração inicial da amostra muito baixa, etc.

Solução: Selecione novamente o filtro MWCO adequado e ajuste os parâmetros de centrífuga para garantir que a concentração inicial da amostra seja superior a 25 μg/ml.

Bloqueio de membrana ou fluxo lento demais

Causa: excesso de partículas na amostra, poluição da membrana de filtro, etc.

Solução: filtre a amostra com antecedência, limpe regularmente ou substitua o filtro. Quando a membrana é encontrada bloqueada, mergulhe com NaOH 0,1 M por 1 hora e enxague três vezes com água pura.

Baixa taxa de reciclagem

Causa: adsorção do filtro, operação inadequada, etc.

Solução: Feche o filtro com 1% de BSA 30 minutos com antecedência para reduzir a adsorção não específica. Cuidado com cuidado durante a operação para evitar danificar a estrutura da membrana.

Depositação de retenção após ultrafiltração

Causa: concentração excessiva de proteína, tampão inadequado, etc.

Solução: ultrafiltrar simultaneamente com vários tubos de ultrafiltro para reduzir a concentração; Alterne o tampão até que a proteína não se precipita. Para a precipitação, centrifugar novamente depois de dissolver com uréia 8M.

IV. Manutenção e manutenção

Limpeza e desinfecção

Tubo centrífugo ultrafiltrado de uso único, descartado diretamente após o uso.

Para reutilização, o tubo ultrafiltrado usado é limpo repetidamente 5 vezes com água pura, depois mergulhado em NaOH 0,1 M por 1-2 horas, depois limpo com etanol a 20% e limpo 3 vezes com água ultrapura ou tampão. Geralmente, não é recomendado reutilizar o tubo de ultrafiltro mais de 5 vezes.

Conservação a longo prazo

Conservação a curto prazo: mergulhe com NaOH 0,1 M por 1-2 horas, limpe com água pura 3 vezes e, em seguida, mergulhe com etanol de 75%, certifique-se de manter a membrana de filtro úmida e não pode prolongar as bactérias.

Conservação a longo prazo: mergulhe com NaOH 0,1 M por 1-2 horas, limpe com água pura 3 vezes e, em seguida, mergulhe com etanol de 20%, certifique-se de manter a membrana de filtro úmida e não prolongar as bactérias.