Autofagia como alvo promissor para a medicação

Autofagia e seus distúrbios foram encontrados em doenças neurodegenerativas e câncerJogarPortanto, a descoberta de novos alvos terapêuticos neste processo tornou-se uma abordagem promissora de medicamentos. A autofagia é um processo regulador que degrada e recupera proteínas e órgãos danificados sob estresse celular.1，2- É.sersacos chamados de autofagosBolha passaFormação de bimembranas ao redor dos componentes celulares marcados como destruídosRealizarMontagem1. As vesículas autofágicas são então fundidas com o lisosoma, transmitindo o seu conteúdo para a degradação da hidrolise do lisosoma.

A autofagia tem vários efeitos fisiológicos e patofisiológicos complexos, como adaptação à fome nutricional, eliminação de proteínas e órgãos intracelulares danificados, desenvolvimento celular, antienvelhecimento, eliminação de micróbios, morte celular, supressão tumoral e apresentação de antígenos2A mitocondria é a degradação seletiva da mitocondria pela autofagia.3Este processo geralmenteaElimina mitocondrias defeituosas após danos celulares ou estresse.

Materiais

• PC12Linhas celulares de neuroblastoma humano (ATCC）

• 384 Placa de buraco (Greiner）

• Cito-ID ®Kit de teste de autofagia (ENZO Ciências da Vida）

• Corente mitocondrial laranja

• Hoechst 33342

• ImageXpressO Pico®Sistema de imagem celular automatizado (Dispositivos moleculares）

• CellReporterXpress (em inglês) Software de coleta e análise de dados（Dispositivos moleculares）

Vantagens

Efeitos dos compostos quantitativos no processo de autofagia

Use marcadores nucleares para dividir células, detectar e caracterizar pequenasobjetos alvo

Garantir resultados estatísticos confiáveis com imagens automáticas

Detecção e quantificação de partículas de autofagos com imagem celular automática

Avaliação dos efeitos da autofagia

Neste documento de aplicaçãoNós avaliamos.ImageXpressPicoEficiência do sistema de imagem celular automatizado para detectar e quantificar partículas de autofagos.PC12Linhas celulares de neurocitoma humano são usadas como modelos de desenvolvimento de detecção. colocar as células em 6，000 umCélulas/Vacinação do buraco384Na placa, incubar48Horas. Para avaliar os efeitos sobre a autofagia,fazerTratar as células com diferentes concentrações de cloroquina ou verapamide48Horas. VilapamipodeInduzir a autofagia, enquanto cloroquinapodeA inibição da degradação dos autofagos resulta no acúmulo de partículas.CompostosApós o tratamento, o usoCito-ID ®Teste de autofagiaKit de Reação para ViverAs células são coloridas paraMostrarRastreamentoAutofagos. Além disso, usamos corantes mitocondriais fluorescentes para detectar mitocondrias e usarHoechstIdentificação do núcleo celular (ConcentraçãoPor separado 0.2 μO Me 1 μO M). UtilizaçãoCombinação20Xou40 vezesObjetivosdoImageXpressPicoSistema e três canais de detecção（FITCeTRITCeDAPI）Para as célulasRealizar imagens. em20XObjetivosAbaixo de cada buraco, coletar uma imagem, em40 vezesSob o ObjetivoCada buraco.Recolha2-4Imagens para garantir resultados estatísticos confiáveis. UtilizaçãoCellReporterXpress (em inglês)Análise de imagens em aplicativos de autofagia ou mitocondria em software de captura e análise de imagens.

Gráfico 1：Teste de autofagos.A imagem acima mostra oPassouIndutor de autofagia cloroquina (30 pM(Tratamento efazerusarCito-IDTinturas coloridasPC12Imagens representativas de células autofágicas e máscaras de análise. emCellReporterXpress (em inglês)No software, a separação de pontos é usada para identificar partículas autofágicas. Núcleo celularMostrar comoAzul, mitocondrialMostrar comoLaranja, autofagia.Mostrar comoVerde. abaixoGráficoMostrarfezTinção de células não tratadas com corantes de integridade mitocondrial laranja- É.Máscara de imagem e análise para detecção mitocondrial.

Esses algoritmos podemaDetecção e caracterização pequenaobjetos alvocomo os autofagos ou mitocondrias na citoplasma, ao mesmo tempo que marcadores nucleares são usados ​​para dividir as células. Quantificação para detecção de autofagiadetecçãoInclui o número total ou médio de partículas, a área total ou média da partícula (objeto subcelular) e a intensidade. Cloroquina (30 μO M(Tratamento)DepoisImagens representativas das células e máscaras analíticas1mostrado. InspeçãotesteCloroquina e VerapamiCélulas após o tratamentoreações de concentração e avaliaçãoCE50Valor. Contagem total de autofagosOs dados mostram,O tratamento com cloroquina e verapamide fazCélulasAumento dos níveis de autofagia4.6vezes e3.3vezes（CE50Os valores são respectivamente4.0e3.6 μO M).

conclusão

Este método eCito-IDcorantesCombinaçãoPode ser usado para detectar partículas de autofagia e pode ser usado para detectar o impacto do desenvolvimento e quantificação de compostos no processo de autofagia.

ReferênciaDocumentação

1. 1. Mizushima, N.; Komatsu, M. (2011). Autofagia: renovação de células e tecidos. Célula. 147: 728–41

2. 2. Mizushima, N.; (2007). Autofagia: processo e função, Genes & Dev. 21: 2861-2873