O desenvolvimento de vacinas, desde pesquisa e desenvolvimento até estudos pré-clínicos iniciais até produção comercial, testes e lançamento em lotes, envolve uma grande quantidade de análises e testes para garantir a eficácia e segurança dos produtos vacinados. A bioanálise no desenvolvimento de vacinas enfrenta desafios como a matriz da amostra, o tipo de analítico e a eficiência do fluxo de trabalho, por exemplo, as amostras de vacinas usadas ​​para análise variam muito e a ampla gama de analíticos, incluindo polysaccharides, proteínas e polipéptidos, que devem ser testados em diferentes matrizes. Além disso, a nova geração de vacinas envolve um número crescente de antígenos, como a vacina contra o HPV (vírus do papiloma humano), que tem vários tipos, como bivalente, tetravalente e nonvalente, o que aumenta significativamente a complexidade do teste. Normalmente usada para determinar a titração, pureza e eficácia de vacinas e suas respostas imunogênicas em animais e seres humanos, a análise imunológica ELISA baseada em placas porosas tornou-se uma das técnicas padrão-ouro na bioanálise de vacinas, incluindo epitopes quantificadores de antígenos, avaliação de níveis de impurezas e monitoramento da titração e imunogênica no desenvolvimento de vacinas. No entanto, o calendário cada vez mais urgente do projeto levou os pesquisadores a começar a buscar melhorias no desempenho da análise imunológica das vacinas, incluindo:

Usar menos quantidades de reagentes valiosos, como moléculas candidatas a vacinas, bem como amostras de pequenos animais experimentais

Os métodos de teste facilitam o processamento de amostras de soro e plasma, aditivos de alumínio e emulsores de óleo

Reduza o tempo de operação

Reduzir o tempo de desenvolvimento de métodos de teste

Gyrolab ® O sistema oferece uma solução para essas necessidades e oferece muitos benefícios adicionais no desenvolvimento de vacinas. A plataforma aberta da Gyrolab suporta o rápido desenvolvimento de testes para uma variedade de analíticos, tipos de amostras e fórmulas e fornece kits prontos para uso para uma variedade de aplicações. Gyrolab em Bioaffy ™ Testes imunológicos nano-atualizados em CDs de microfluidos minimizam a interferência de várias matrizes e o consumo de amostras e reagentes é pequeno para atender às necessidades de vacinas de última geração e pequenos experimentos em animais; A análise paralela de vários analíticos em padrões de alto fluxo e automação reduz significativamente o tempo prático e permite fornecer dados rapidamente, atender a cronogramas de projetos desafiadores e tomar decisões mais rápidas. As estações de trabalho do software Gyrolab cumprem os requisitos da Parte 11 da 21 CFR e os métodos de teste e dados desenvolvidos atendem aos requisitos do ambiente regulatório e podem ser transferidos sem problemas entre fábricas farmacêuticas e CROs.

　　Este artigo descreve vários casos de aplicação para melhorar o desempenho e a eficiência do desenvolvimento de vacinas usando o sistema Gyrolab para ilustrar as vantagens do sistema Gyrolab no uso prático.

Caso 1:Detecção de anticorpos específicos de antígeno no soro em 1,5 hora

Detectar a quantidade e qualidade de anticorpos produzidos por células B de memória (CBM) em indivíduos vacinados é fundamental para entender como induzir anticorpos protetores ao longo da vida. A frequência relativa das células B de memória específicas de antígenos do sangue periférico humano é geralmente determinada por meio de ensaio de diluição limitada em série (sLDA) e análise de ELISA sobre líquido de cultura celular, mas esse método é demorado e exigente e consome uma grande quantidade de material experimental, portanto, os pesquisadores de desenvolvimento de vacinas e diagnósticos da Novartis transferiram o imunoassay ELISA para o sistema Gyrolab para aumentar o rendimento. O objetivo do estudo foi vacinar ratos após a combinação do antígeno Neisseria com três auxiliares para determinar o subtipo de IgG produzido pelas células B de memória do rato por meio de testes imunológicos. Os pesquisadores testaram duas formas de teste:

　　Ensaio Direto (Direct Assay)

Usado para avaliar: a capacidade do antígeno biotinizado de se ligar à coluna de afinidade da micina de cadeia média do Gyrolab Bioaffy Microfluidic CD e capturar IgG específica; ② Detectar a sensibilidade de anticorpos específicos de antígeno no líquido de cultura celular superior; É avaliada a afinidade da ligação de anticorpos a antígenos específicos através da curva de ligação no Gyrolab Viewer.

　　Ensaio Reverso (Reverse Assay)

Utilizado para avaliar a capacidade do marcador de fluorescência Alexa para detectar antígenos específicos IgG ligados à coluna de afinidade do CD.

Ensaio Direto

Diagrama 1: O teste Gyrolab e ELISA identificaram as mesmas amostras positivas e negativas em serum de cultura de células B de camundongos submetidos a vacinação contra a bactéria Nesser. O eixo Y é a título dos anticorpos detectados pelo Gyrolab e a amostra positiva identificada pelo ELISA é marcada com uma caixa verde.

O método de detecção direta Gyrolab é capaz de detectar simultaneamente anticorpos pertencentes a diferentes subtipos de IgG em amostras de alguns microlitros.

O teste de anticorpos específicos de antígeno em um sistema Gyrolab apresenta muitas vantagens em comparação com o ELISA, com apenas alguns microlitros de amostra necessários para analisar a massa da resposta de anticorpos, ou seja, o número relativo de subtipos IgG.

Caso 2:Triagem de reagentes - comparação de lotes de vacinas para testes de liberação

A bioanálise de vacinas multivalentes está se tornando cada vez mais complexa e exige o desenvolvimento de um grande número de métodos de teste. Como as vacinas multivalentes contêm vários antígenos, métodos de teste de liberação devem ser desenvolvidos para cada componente antígeno para garantir a dose e a eficácia, então o número de testes para cada produto deve ser multiplicado pela quantidade de antígeno. A equipe de desenvolvimento de análises de vacinas da Merck desenvolveu um método altamente flexível de teste Gyrolab que minimiza o desenvolvimento de métodos de teste de vacinas polivalentes e o consumo de reagentes (como anticorpos de teste marcados, etc.). O método baseia-se em IgG anti-rato de cabra biotinada fixada em uma coluna de afinidade de cadeia no CD do Gyrolab Bioaffy, adicionando anticorpos de captura específicos do analítico (por exemplo, mAb alfa-PS de rato) e adicionando amostras para detectar o analítico capturado com um segundo anticorpo específico do analítico (por exemplo, pAb alfa-PS de coelho) e, finalmente, com Alexa Fluor. ® Anticorpos anti-coelho de burro marcados com 647 foram testados por fluorescência (Figura 3). Essa forma de teste de 5 camadas de "duplo clamp" não precisa marcar um reagente específico para o analítico e os reagentes específicos para o analítico podem ser facilmente substituídos, de modo que o desenvolvimento mínimo é necessário para a detecção de vacinas polisacáricas e proteicas polivalentes e diferenças entre lotes de anti-soros.

Figura 3. Forma de detecção de Gyrolab de 5 camadas "duplo clamp". PS: Analisador de açúcar

O teste Gyrolab foi usado para comparar dois lotes de anti-soro contra três testes de antígeno. O uso do módulo de software Gyrolab Viewer permite visualizar a resposta combinada de cada ponto de dados na coluna de afinidade no microcanal do CD, o que torna os dados comparáveis com curvas de potência mais demoradas (Figura 4).

Painel A: Comparação de lotes anti-séricos de antígenos A, B e C usando dados de intensidade de fluorescência (esquerda) e curva de resposta (direita). Painel B: O Gyrolab Viewer do antígeno B combina imagens de curva de intensidade que mostram baixa intensidade de fluorescência na coluna do novo lote e aumento do pico de atraso, indicando que a afinidade de anticorpos do lote é menor do que a antiga.

Embora os dois lotes tenham um desempenho semelhante contra o antígeno A, os lotes antigos têm um desempenho melhor contra o antígeno B, com uma área de pico maior combinada com o espectrograma no Gyrolab Viewer e uma relação de sinal-ruído maior durante a titulação. Os novos lotes mostraram um atraso de fluorescência evidente na coluna, o que sugere uma menor afinidade com o antígeno. Para o antígeno C, ambos os lotes de anti-soro mostraram atraso evidente, enquanto os antigos lotes de anti-soro mostraram mais atraso pico. No momento da titulação, o fundo do lote antigo é alto e o sinal e o ruído são baixos. Assim, a visualização do Gyrolab Viewer combina espectrogramas, curvas de resposta e razões de sinal-ruído para fornecer informações valiosas sobre os lotes anti-serológicos.

A equipe da Merck concluiu que o sistema Gyrolab fornece valiosos dados estatísticos e gráficos que, quando avaliados juntos, são consistentes com os dados de detecção baseados em placas porosas, juntamente com benefícios adicionais como tempos de rotação rápidos, alto fluxo e capacidade de combinar a força da visualização.

Caso 3:Ampliação do intervalo dinâmico quantitativo da titulação de antígeno para 4 logs

As empresas de desenvolvimento de vacinas precisam ampliar o escopo dinâmico da imunologia para medir os antígenos glicoproteínicos adsorvidos a auxiliares de alumínio. Os pesquisadores transferiram o ELISA para o sistema Gyrolab, expandindo a faixa dinâmica de 5-300 mIU / mL para ~0,6-40 000 mIU / mL, com o teste Gyrolab expandindo os limites quantitativos superior e inferior simultaneamente.

Figura 5: O Gyrolab fornece um método de detecção poderoso que amplia significativamente a gama dinâmica na medição da titulação de antígeno.

Caso 4:Ensaios de eficácia da vacina para o desenvolvimento de fórmulas

A avaliação da consistência da eficácia entre lotes é um componente importante do controle de qualidade da vacina. Os testes de eficácia podem ser usados ​​para estudos de estabilidade, validação e otimização de processos de fermentação e purificação, comparação de instalações novas e antigas e avaliação do efeito de alterações de fórmulas ou auxiliares.

A Merck comparou o desempenho do sistema Gyrolab com o teste Luminex em ensaios de eficácia em ratos. O estudo envolveu imunidade in vivo em camundongos, diluindo amostras de antígeno normalizadas para uma faixa de concentrações de dose de 6 a 12. A dose eficaz (ED50) é determinada com base na dose máxima de 50% da conversão sérica de ratos em cada grupo de administração, e até 220 amostras séricas de ratos são necessárias para obter um valor de ED50, portanto, este trabalho pesado requer grandes quantidades pequenas de amostras. O teste Gyrolab provou ser confiável e robusto, com uma sensibilidade e reprodutividade (CV < 10%) comparáveis às medições Luminex (R2 = 0,97), mas com tempos de operação mais curtos e tempos de rotação mais rápidos.

Figura 6. O teste Gyrolab é altamente repetitivo, CV<10%

Figura 7. Os resultados dos testes imunológicos de Gyrolab e Luminex são comparáveis