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　　Otimize rapidamente as condições de síntese de PNA com o PurePep Chorus multicanal multifuncional

Os ácidos nucleicos peptídicos (PNA) são análogos de DNA com esqueletos polipeptídicos e possuem várias propriedades físicas e químicas. O esqueleto da cadeia principal do PNA é feito de N(2-aminoetil)-glicina ligada a uma base de ácido nucleico por meio de um submetilo.

Figura 1: Estrutura do ácido nucleico peptídico e ligação ao DNA

Os análogos não iónicos de nucleácidos peptídicos, como o PNA não tem carga negativa, não há repulsão eletrostática entre o DNA e o RNA, a estabilidade e a especificidade da ligação são muito melhoradas, e a capacidade de híbrido com moléculas de DNA ou RNA é muito melhor do que o DNA / DNA ou DNA / RNA, mostrando-se em alta estabilidade de híbrido, excelente capacidade de reconhecimento de sequências específicas, não hidrolizada por nucleases e proteases.

PNAs podem inibir a expressão de genes através da complementaridade de ligação de RNAs. E em condições específicas, a expressão genética também pode ser promovida através de mecanismos de invasão em cadeia ligados a sequências de dupla cadeia de DNA. Com base nas vantagens acima mencionadas, os PNAs foram amplamente utilizados em várias áreas durante quase uma década, e sua alta afinidade e especificidade os tornaram não apenas agentes terapêuticos, mas também ferramentas poderosas em aplicações diagnósticas.

À medida que a pesquisa básica da PNA se aprofunda e novas tecnologias surgem, a PNA apresentará um melhor desempenho e uma perspectiva de aplicação mais ampla.

　　Os desafios atuais

Devido à facilidade de agregação durante a síntese e às muitas reações secundárias durante a desprotecção, a síntese de PNAs apresenta grandes desafios. Para problemas de fácil agregação, a estratégia comum é usar um excesso de reagente na reação de condensação. No entanto, o preço do reagente monómero PNA para a proteção da extremidade N sintética é relativamente alto e o método não é amplamente utilizado. Portanto, é necessário desenvolver um processo de síntese relativamente econômico para ajudar as PNAs a serem comercializadas com sucesso.

　　Otimização das condições de síntese no PurePep Chorus

Neste artigo, mostraremos a rápida otimização das condições de síntese do PNA em um sintetizador automático PurePep Chorus.

O PNA 1 será usado em sequências de referência para analisar diferentes parâmetros de síntese, como o coeficiente de sobredose do monômero PNA, o tempo de reação e a temperatura. A síntese de PNA-1 em condições de pureza mais elevada será usada para sintetizar outras 5 sequências de comprimento diferente e conteúdo de purina (adenina e avipurina) (ver Tabela 1). A pureza é um fator-chave no exame da síntese, devido ao grande bloqueio de bits espaciais do monómero PNA, que pode causar uma reação de condensação incompleta que resulta em baixa pureza.

Tabela 1: Informações da sequência PNA envolvidas neste caso

O PNA 1 foi sintetizado com um sintetizador de polipéptidos PurePep Chorus com um equivalente sintético de 25 μmol, usando uma resina Rink Amide MBHA de substituição de 0,27 mmol/g e seguindo o esquema de proteção ortogonal Fmoc/tBu. Desproteção do grupo Fmoc na resina com uma solução de DMF a 20% de pepidina e reação a temperatura ambiente por 5 minutos x 2 vezes; Reações sintetizadas usando sistemas de HCTU e NMM, com detalhes específicos da reação na Tabela 2. Depois da reação de condensação, executar a operação de fechamento, usando uma solução de anhidrido acético de 10% DMF e reagir a temperatura ambiente por 5 minutos. Após a última etapa de desprotecção, a resina é colocada no líquido de corte (TFA: TIS: H2O = 95: 2,5: 2,5) e reage a temperatura ambiente durante 4 horas.

As operações acima permitem configurar diferentes protocolos no software no Chorus de acordo com as condições necessárias, o software calcula automaticamente as doses necessárias, o instrumento é executado automaticamente, economizando ainda mais operações manuais e garantindo que o programa de teste seja rigorosamente executado.

Tabela 2 Estudo das condições de condensação

A partir da análise dos dados da Tabela 2, podemos descobrir que a pureza do produto bruto atinge 81% quando o PNA é 10 vezes o equivalente da reação; No entanto, com base no alto preço do monómero Fmoc-PNA, a matéria-prima sintética, o projeto acima não é facilmente aceitável. Reduz o coeficiente de reação do PNA para quatro vezes e reduz a pureza da matéria prima do produto para 72%. Mantendo o coeficiente de equivalência de reação do PNA em quatro vezes, elevando a temperatura de reação para 45 ° C e reduzindo o tempo de condensação para 5 minutos, a pureza da matéria prima do produto diminuiu ainda mais para 61%. Assim, o tempo de reação de 5 minutos é muito curto para a reação de condensação. Neste momento, as outras condições permaneceram inalteradas, aumentando o tempo de reação sozinho para 10 minutos (Experimento D) e a pureza do péptido bruto atingiu 82%, semelhante aos resultados do Experimento A. O experimento E foi usado para examinar as condições da reação, ajustando o coeficiente de equivalência da reação para 2 e fazendo duas reações de amostragem. Usando a mesma quantidade total de matérias-primas de reação e no mesmo tempo de condensação, a pureza da matéria-prima do produto foi melhorada em 5%.

Determinamos as condições de síntese com base nos valores mais altos de pureza do produto PNA 1 e as várias sequências restantes serão sintetizadas da mesma maneira que o PNA 1 (ou seja, o método E). Os resultados são mostrados na Tabela 3:

Tabela 3: Resultados brutos da síntese dos 5 PNAs restantes usando o Método E

Os cinco produtos de pós-síntese do PNA acima têm uma pureza bruta entre 66-91%, o que resulta satisfatório para o ácido nucleico peptídico. Curiosamente, os produtos PNA com maior teor de purina têm maior pureza.

Figura 2: cromatografia de cinco produtos PNAs coletados com o sistema UPLC-UV a comprimentos de onda de 210 nm. O sistema UPLC é Waters H-class UPLC/ESI-MS com coluna cromatográfica C18 (1,7 μm, 2,1 x 50 mm). A fase de fluxo é de 0,1% TFA em uma solução misturada de água (A) e acetonitril (B).

　　Resumo

Neste documento de aplicação, discutimos em detalhe como otimizar a síntese de PNA usando o sistema PurePep Chorus. Inicialmente, usamos 10 vezes o equivalente de reação de PNA para sintetizar a temperatura ambiente durante 1 hora, o método permitiu obter um produto bruto de pureza de até 81%. Estamos empenhados em reduzir o uso de reagentes e minimizar seu impacto na pureza da matéria-prima, tornando-a mais econômica, sustentável e em conformidade com os requisitos da química verde. Eventualmente, desenvolvemos métodos que reduzem a quantidade de reagentes e são puros e elevados. Usando o método de condensação 2 vezes, cada amostragem com 2 vezes o equivalente de reação, a reação em 45 ° C por 5 minutos, a pureza do PNA 1 pode ser aumentada de 81% para 87%. Finalmente, o método foi aplicado para a síntese de outros cinco PNAs.

Para os péptidos nucleicos de diferentes comprimentos e diferentes teores de pura, este método pode obter produtos muito bons. O sintetizador de péptidos PurePep Chorus é uma ótima ferramenta para esse trabalho, pois o esquema de síntese pode ser ajustado com flexibilidade conforme necessário; Por exemplo, modifique o coeficiente de reação, o número de repetições, a temperatura e o tempo. Ao mesmo tempo, a capacidade de cálculo automático de instrumentos e softwares automatizados ajuda a reduzir as operações manuais, reduzir o risco de falhas e as condições de síntese otimizadas podem ser facilmente aplicadas à síntese de outros PNAs.