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Como tornar a análise de resíduos de proteína celular hospedeira (HCP) mais eficiente e confiável
Datas:2024-12-10Leia:1
A proteína de célula hospedeira (HCP) é uma proteína não-alvo produzida ou codificada pelas células hospedeiras (CHO, HEK293, E.coli, Sf9, etc.) e é o principal componente das impurezas relacionadas ao processo nos biomedicamentos. Embora a grande maioria das proteínas de célula hospedeira (mais de 99%) sejam removidas no processo downstream, ainda pode haver pequenas quantidades de resíduos de HCP co-purificados com produtos farmacêuticos, alguns dos quais são considerados HCPs de alto risco, podem ser imunogênicos, bioativos ou enzimáticos, ou podem degradar moléculas ou aditivos do produto, com um impacto significativo na qualidade e segurança do medicamento, portanto, tais HCPs de alto risco são o foco da preocupação das empresas farmacêuticas e reguladoras.
O sistema de expressão CHO de células ovárias de hamster chinês tem sido um dos sistemas de expressão de mamíferos mais comuns na produção de medicamentos biotecnológicos como o monomab, porque é capaz de produzir proteínas complexas modificadas após tradução semelhantes às produzidas pelos seres humanos. A purificação a jusante do líquido de cultura de células CHO geralmente inclui a estratificação de afinidade da proteína A, seguida de etapas puras para remover ainda mais agregados, variantes de carga, HCP e DNA da célula hospedeira. A grande maioria do HCP é eliminada durante o processo de purificação, mas pode haver alguns HCP que "escapam" da eliminação devido a duas maneiras:
1
HCP tem a capacidade de se combinar com a especificidade ou não especificidade do produto e é transportado durante o processo;
2
HCP tem a capacidade de interagir com o preenchimento de cromatografia de proteína A, levando a sua lavagem conjunta com o produto.
Perigos e classificação do HCP
O risco potencial do PCH é afetado por vários fatores, incluindo indicações farmacológicas, vias de administração, frequência de administração, número de PCH por dose administrada, população de doentes, homogeneidade do PCH com contrapartes humanas e experiência não clínica e/ou clínica anterior.
Impactos potenciais do HCP na qualidade, segurança e eficácia dos produtos:
Imunogênio:Anticorpos resistentes a medicamentos, induzir a produção de citoquinas, etc.
Eficiência:Agregação ou degradação de proteínas
Estabilidade: Aditivos de degradação de lipases
Segurança:Interações com proteínas endógenas, efeitos de agentes imunológicos
A equipe de trabalho do BPDG HCP divide os efeitos do HCP de alto risco em quatro categorias com base na capacidade de um único HCP de co-purificação com o produto, a frequência com que ocorre no processo downstream, a sua capacidade de alterar ou degradar medicamentos / adjuvantes e a sua potencial imunogênica:
1) qualidade do produto, 2) preparação, 3) função biológica direta para o corpo humano e 4) imunogenicidade.
Existem várias abordagens para identificar e quantificar os níveis de PCH específicos completos e individuais presentes durante o desenvolvimento de medicamentos. Cada método tem suas vantagens e desvantagens. As impurezas conhecidas de HCP podem ser medidas corretamente de acordo com as seguintes estratégias de análise abrangente e, se forem identificadas como HCP de alto risco, estratégias de controle são desenvolvidas para monitorar e/ou eliminar essas impurezas.
01 A medição do HCP total por meio de imunoassays, como ELISA, é o principal instrumento para determinar os níveis de HCP residual para orientar o desenvolvimento do processo e apoiar o teste de liberação em lote GMP. Os reagentes-chave necessários para o desenvolvimento do imunoassay total do HCP devem ser caracterizados em detalhes.
02 A espectroscopia de massa deve ser realizada após métodos ortogonais adicionais, como eletroforese em gel 2D / Western, e / ou extração de afinidade de anticorpos (AAE), para avaliar a cobertura de reagentes de anticorpos críticos para o HCP específico do processo.
03 A imunologia total de HCP deve ser realizada regularmente para determinar os níveis de HCP em amostras de processo.
04 Recomenda-se a utilização de métodos ortogonais, como espectroscopia de massa e/ou métodos adicionais de detecção de HCP individual, para garantir a pureza do produto, especialmente quando os imunoassays detectam níveis elevados de HCP total, observam diluição não linear ou observam efeitos de qualidade do produto.
05 Se um HCP individual for identificado e considerado potencialmente de alto risco:
um
Pode ser necessário desenvolver um imunoassay específico para monitorar impurezas conhecidas ou desenvolver um método de espectroscopia de massa direcionado para entender melhor os níveis de HCP e seus potenciais efeitos.
b) O
Se a impureza identificada tiver atividade enzimática, um método de atividade pode ser desenvolvido para orientar o desenvolvimento de processos e produtos, monitorar, remover e / ou inativar a proteína.
(c)
A avaliação da imunogenicidade é realizada por meio do método in silico e, se as previsões indicarem um alto risco de imunogenicidade, a Avaliação Comparativa de Imunogenicidade in vitro (IVCIA) pode ser realizada.
d
Estudos toxicológicos avaliam os riscos clínicos.
Os métodos usados para análises qualitativas e quantitativas do HCP total são principalmente imunoassays, geralmente usando um ou mais métodos ELISA. No entanto, o ELISA tradicional tem as seguintes limitações:
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Múltiplas etapas de incubação e lavagem requerem muito tempo de operação prática e análise e fluxos de detecção de amostras são muito limitados;
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A faixa dinâmica é estreita (±100 ng/mL) e exige uma grande quantidade de testes repetidos durante os estudos de processo downstream;
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O consumo de amostras e reagentes é grande, o que representa um desafio para a detecção de níveis específicos de HCP baixos, porque é muito difícil produzir HCP suficiente a partir de substâncias farmacêuticas. Isso coloca o ELISA em um gargalo de gargalo para atender à crescente velocidade, fluxo e consumo de volume de amostra das equipes de desenvolvimento de processos downstream.
Por isso, cada vez mais empresas farmacêuticas estão se voltando para plataformas de análise imunológica de alto fluxo que ajudam a aumentar o fluxo e acelerar a rotação, como o Gyrolab da Gyros.®Plataforma totalmente automática de análise imunológica, a tecnologia Gyrolab usa microesferas encaixadas com molho em cadeia para capturar o reagente de captura biotinizado, que combina a amostra com o reagente de captura para detectar a amostra combinada com um reagente de teste marcado com fluorescência. Essa imunoassay em Flow-through em colunas de afinidade é muito rápida e não requer tempo de incubação, reduzindo significativamente o tempo necessário para concluir a análise e o consumo de amostras e doses em comparação com o ELISA convencional. A operação de controle totalmente automatizada proporciona uma excelente repetibilidade à detecção Gyrolab. Assim, o método de análise de alto fluxo da Gyrolab Automation oferece um suporte eficaz para a análise de HCP no desenvolvimento de processos e na inspeção de liberação de QC:
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Eficiência de rotação analítica rápida;
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Excelente fluxo de detecção;
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A qualidade dos dados é confiável e os resultados são repetidos.
Em geral, essa abordagem melhora a eficiência do departamento de bioanálise, reduz significativamente o tempo de operação manual, elimina os requisitos de re-medição devido a erros de diluição ou erros de operação humanos e melhora significativamente o rendimento, a qualidade e a repetibilidade dos resultados da análise.
