Efeito matriz / interferência matriz refere-se a outras substâncias na amostra que podem afetar a capacidade de detectar o analítico alvo, o que é mais comum em testes imunológicos em amostras biológicas, como soro, plasma, homologação de tecidos, etc., porque muitos componentes nessas amostras, como carboidratos, proteínas, fosfolípidos, metabólitos, etc., podem interferir na ligação de anticorpos a seus alvos, ou inibir ou aumentar o sinal, afetando a quantificação precisa do analítico.

A interferência da matriz é um grande desafio na bioanálise em estudos clínicos, por exemplo, vários tipos de interferência foram encontrados no soro e no plasma, geralmente em substâncias endógenas como reumatoides, anticorpos heterofílicos (com baixa afinidade e ligação fraca a anticorpos produzidos contra antígenos indeterminados), anticorpos humanos contra animais (HAAA, anticorpos de alta afinidade produzidos quando o sistema imunológico entra em contato com anticorpos animais) e outras proteínas do plasma, como albinase, lysoase, fibrogênios, etc. [1] Esses fatores interferentes afetam diretamente a sensibilidade, especificidade e variabilidade do teste, resultando em quantificações imprecisas do analítico.

A maneira mais básica de reduzir o efeito da matriz é diluir a amostra, mas desde que os níveis de analítico após diluição ainda estejam dentro da faixa linear e a diluição afete a sensibilidade da detecção, por isso não é uma estratégia comum. Otimizar o pH do tampão e a intensidade iónica também ajuda a reduzir as interações não específicas. Outras estratégias para superar a interferência incluem a adição de substâncias que se ligam ou competem com moléculas interferentes, como a remoção passiva de anticorpos humanos contra ratos (HAMA) com um cocktail sérico animal apropriado, o uso de inibidores de anticorpos heterofílicos como o bloqueador de heterofilidade (HBR) e o inibidor de imunoglobulina (IIR), ou o uso de F(ab′)2 ou fragmento de cadeia única (scFv) com falta de fragmento Fc como reagentes de captura / detecção [3], embora a maioria desses métodos seja intensiva de mão-de-obra e cara e não seja prática para estudos com grandes volumes de amostra.

Para testes imunológicos baseados em ensaios de ligação de ligando (LBA), reduzir o tempo de incubação ou o tempo de contato do reagente com a matriz provou ser um dos meios eficazes para superar o efeito da matriz [4].Gyrolab ® Realizar um padrão de filtragem de coluna afinidade em um CD microfluidizado minimiza o tempo de contacto do reagente com a matriz e minimiza a interferência da matriz.Shannon D. Chilewski, da Bristol-Myers Squibb, e outros[5] usam Gyrolab ® A plataforma resolve o problema da interferência da matriz em estudos pré-clínicos de PK.

O caso foi observado em um teste PK de um anticorpo PEG, com interferência da matriz derivada de anticorpos humanos anti-animais (HAAA). Na fase de descoberta de drogas, os métodos de detecção usados ​​para apoiar os estudos de dose ascendente única (SDA) são baseados em métodos de detecção eletrocímica luminescente (ECL), com moléculas alvo como reagente de captura, anticorpos anti-Vk de cabra como reagente de detecção, com diluição de amostra de 50 vezes e LLOQ limite inferior quantitativo de 80 ng / mL.

No entanto, a transição da fase de descoberta para a fase de desenvolvimento exige uma menor sensibilidade de detecção e, ao mesmo tempo, mantém ou melhora a precisão e a precisão, e o LLOQ do método de detecção ECL de 80ng / mL não é adequado para apoiar a próxima fase do estudo por três razões:

A equipe de desenvolvimento está interessada nas características da meia-vida do medicamento em doses mais baixas e os resultados podem ser

2 Deseja medir a concentração do fármaco no ciclo quando a participação do receptor EC50 é de 78 ng / mL;

Em caso de imunogénia, os anticorpos resistentes podem ter um efeito de limpeza sobre a droga, reduzindo os níveis de droga na circulação, portanto, a dedução é que o método de teste restringe ainda mais a quantificação da droga em doses mais baixas.

　Para aumentar a sensibilidade da detecção e expandir o LLOQ para os 30ng/mL necessários, a equipe de pesquisa explorou a adoção de Gyrolab. ® A combinação de plataformas e novos reagentes permite desenvolver rapidamente novos métodos de teste em um tempo limitado.

Primeiro no Gyrolab ® A combinação de reagentes de captura e detecção foi triada com anticorpos anticlonais de cabra como reagente de captura e monomab anti-específico de rato como reagente de detecção, e esta combinação mostrou o melhor desempenho, a concentração de anticorpos de captura foi de 100 µg / mL e a concentração de anticorpos de detecção foi de 2500 ng / mL. Utilização do Gyrolab ® Bioaffy 200 CD (volume de amostra 200nL) e Gyrolab padrão ® Método de três etapas (captura-analítico-teste) para a análise, a diluição da amostra MRD é de 2.

PBS-T como tampão de diluição (PBS + 1% BSA + 0,05% Tween-20), diluir a amostra duas vezes. Foram realizados seis testes de CD em 3 dias. Cada CD inclui uma curva padrão e quatro repetições de amostras de QC de 6 níveis. A faixa de curva padrão é de 30-2000ng / mL e o ponto de âncora é de 2500ng / mL. A amostra de QC é diluída 125 vezes em soro humano 100% e, em seguida, diluída 2 vezes com tampão de detecção para que a concentração caia dentro da faixa de medição. A Tabela 1 mostra que todos os resultados têm uma boa precisão e precisão de teste.

Comparação paralela de amostras diluídas com tampão PBS-T e tampão Rexxip H (Gyros), patenteado pela Gyros, respectivamente. Como o método de detecção contém monomab de rato, o anticorpo humano anti-rato HAMA é uma fonte potencial de interferência e o tampão Rexxip H contém anticorpos neutros e heterofílicos, a diluição com Rexxip H deve inibir o sinal de interferência da matriz.

20 amostras de soro (10 sérios NHS1-10 em pessoas normais e 10 sérios DPS1-10 em populações doentes) foram analisadas com drogas incorporadas a concentrações LLOQ de 30 ng/mL e todas as 20 amostras foram analisadas sem marcação. Critérios de aceitação: 80% das amostras marcadas devem ser recuperadas dentro de um desvio de concentração nominal de ± 25%, e todas as amostras não marcadas devem ser recuperadas abaixo do LLOQ. Os resultados (Tabela 2) mostraram que as amostras de soro humano normal cumpriram os critérios de aceitação alvo após diluição com tampão Rexxip H. Amostra de soro humano normal 2, com uma taxa de recuperação de 252,6% com PBS-T e uma taxa de recuperação de menos de 25% com Rexxip H, indica que o tampão Rexxip H eliminou muito bem a interferência da matriz na amostra. Duas dessas amostras de soro da doença tiveram concentrações inversas de 32 a 35 ng/mL sem amostragem, mesmo com o uso de tampão Rexxip H. Assim, no projeto de estudo em populações com doença, é necessário repetir o experimento de marcação, projetando LLOQ para 40ng / mL.

Resumo:

Transferência do método de detecção eletroquimicamente luminescente (ECL) (LLOQ 80ng/mL) para o Gyrolab ® Na plataforma, o uso de pares de anticorpos e tampões otimizados resultou em resultados de detecção mais sensíveis, melhorando o LLOQ para 30ng / mL, o que pode atender aos requisitos de estudos futuros.

Gyrolab ® O padrão de fluxo de coluna de afinidade da plataforma e o tampão Rexxip patenteado minimizam a diminuição da precisão e sensibilidade dos dados causada pelo efeito da matriz.

Para outros casos em que o Gyrolab reduziu os efeitos da matriz, entre em contato conosco clicando em ler o texto original.

Referências:

[1]. Selby C. Interferência no imunoassay. Ann Clin. Bioquímica. 36(Pt 6), 704-721 (1999).

[2]. Ana I. Barbosa, Nuno M. Reis. A cobertura da superfície dos anticorpos impulsiona a interferência da matriz em imunoassays capilares microfluídicos. Sensores ACS 2021 6 (7), 2682-2690.

[3]. Williams K, Erickson R, Fischer SK. Superar o efeito da matriz específica da doença em um ensaio farmacocinético clínico usando uma tecnologia de imunoassay microfluidic. Bioanálise, 9(16), 1207–1216 (2017).

[4]. Saloumeh K. Fischer (em inglês). Tecnologias de ensaio de ligação de ligando: combinar a ferramenta certa ao seu desafio bioanalítico. https://www.bioanalysis-zone.com.

[5]. Shannon D. Chilewski. Abordar os efeitos da matriz em ensaios de ligação de ligandos através do uso de novos reagentes e tecnologia. Bioanálise (2014) 6(8), 1059-1067.