Vesículas extracelulares (EV) evoluiu rapidamente na última década, com muitas descobertas e relatórios sobre sua origem, relevância com a doença e diagnóstico e tratamento. Nestas áreas de estudo, a caracterização abrangente do EV é essencial e requer análises de partículas individuais e holísticas do EV, como tamanho de partícula, potencial, concentração, distribuição de tamanho de partícula, e a detecção de proteínas características associadas ao EV, como CD9, CD63, CD81, Alix e TSG1012-5. Para uma análise mais aprofundada do fenótipo de EV, é necessário realizar a análise de fenótipo de EV usando métodos como Western blotting, ELISA ou marcadores imunológicos monovesículos/globais.
Atualmente, não existe uma maneira de combinar o teste de proteína em uma única vesícula com o teste global.Distribuição de tamanho de partículascombinado com a medição de concentração. A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é uma técnica usada para caracterizar a distribuição de tamanho de partículas EV. A NTA é baseada na equação de Stokes-Einstein, rastreando partículas individuais.Movimento BrownDeterminar o tamanho de EVs individuais e grupos de EVs. Utilizando partículas irradiadas a laser, a NTA pode, em teoria, permitir a estimulação específica de corantes fluorescentes e a detecção de marcadores fluorescentes EV (NTA-FL).No entanto, apenas alguns estudos atualmente avaliaram rigorosamente a NTA-FL e esses estudos dependem de alvos de proteínas EV atípicos ou marcadores imunológicos não específicos.- É.
Universidade Tufts (EUA)Universidade TuftsOs pesquisadores relataram um algoritmo otimizado para fluorescente imunomarcador único EV para NTA-FL, tornando o imunomarcador único vesícula baseado em NTA e a detecção com maior precisão com a distribuição de tamanho de partícula e análise de concentração. O algoritmo aumenta efetivamente a credibilidade dos resultados do teste NTA, fornecendo ferramentas poderosas para estudar mais profundamente as funções e mecanismos do EV.- É.
Em estudos anteriores, os pesquisadores descobriram利用NTARealizarEVAnálise de fluorescência de subtipos/Quando o método de comparação de luz dispersa ocorre desvio de dadosNormalmente, a proporção entre a área circundada pela curva de fluorescência (FM) e a área circundada pela curva de luz dispersa (LSM) pode indicar a pureza do EV. Mas, durante a análise, os pesquisadores descobriram que, nos testes 1, 2, 4 (Tabela 1, Figura 1), a relação entre FM (linha azul) e LSM (linha vermelha) era maior que 100%, indicando que a pureza do EV era maior que 100%, o que é claramente irracional.Durante a detecção de fluorescência, pode haver uma grande quantidade de sinais falsos.
As limitações técnicas do sistema NTA impedem que o LSM detecte EVs muito pequenos ou outras partículas com baixa refração.No modo de luz dispersa, a detecção de EV é incompleta e alguns dados EV não são detectados, tornando a área LSM pequena, resultando em um valor maior que 100%.
Os pesquisadores também descobriram que o padrão FM também apresenta picos de sinal evidentes nas áreas abaixo de 50 nm, em comparação com o padrão LSM, onde o sinal diminui basicamente a 0 abaixo de 50 nm, o que também pode ser uma das razões para a proporção ser maior que 100%.Especificamente, isso pode ser porque as moléculas fluorescentes livres não foram removidas adequadamente e as proteínas livres no sistema foram marcadas por moléculas fluorescentes, causando um aumento do sinal fluorescente em partições de pequeno tamanho.
Tabela 1 Relação entre a área de fluorescência (FM) e a área de luz dispersa (LSM) de diferentes amostrasFigura 1 Resultados do teste NTA em diferentes amostras no modo FM e no modo LSM
Para resolver essa situação, os pesquisadores apresentaram dois métodos de avaliação:
O primeiro método.É o método de cálculo tradicional de calcular o número de partículas em uma amostra maior que 50 nm e comparar o número de partículas em FM e LSM para obter a proporção entre FM e LSM. (Figura 2b, c)
O segundo método.É um método de cálculo otimizado que calcula a área de sobreposição entre as curvas de distribuição de tamanho de partículas obtidas por ambos os métodos e compara essa área com o número total de partículas no LSM maior que 50 nanômetros para obter uma proporção de área de sobreposição. (Figura 2D)
Durante o estudo, os pesquisadores enfatizaram suas escolhas sobre a seleção do tamanho das partículas. Para analisar o EV com mais precisão, os pesquisadores reduziram o escopo da análise para50-200 nanômetrosEscolhemos esta faixa porqueA maioria dos tamanhos dos EVs está nessa faixaAlém disso,Capacidade limitada do LSM para detecção de partículas menores de 50 nmpartículas maiores de 200 nanômetros podem não ser EV. Portanto, reduza o escopo da análise para50-200Nano pode efetivamente excluir outros tipos de partículas, melhorando a precisão dos resultados da análise- É.
Figura 2 Esquema do algoritmo de marcação imunológica baseado em NTA
Com base nesse algoritmo de otimização, os pesquisadores analisaram os dados dos seis grupos de amostras acima, mostrando que a pureza do EV caiu para menos de 100%.
Tabela 2 Proporção de área de fluorescência (FM) a área de luz dispersa (LSM) (SA) de diferentes amostras otimizadas pelo algoritmo
Os algoritmos acima utilizam a marcação de pontos quânticos e a tecnologia NTA-FL para identificar e analisar eficazmente diferentes subtipos de EV no nível de uma única vesícula, comparando os resultados de padrões de fluorescência (FM) e luz dispersa (LSM), e fornecendo informações mais precisas sobre a distribuição de tamanho de partícula. No entanto, embora a tecnologia NTA-FL e os algoritmos de otimização possam efetivamente melhorar a precisão da análise de subtipos EV, também é necessário reconhecer algumas limitações no princípio subjacente da tecnologia NTA.NTA na detecção de veículos EV muito pequenos ouLargura da distribuição do tamanho das partículasdoamostras (especialmente amostras EV)Existem certas vezesDificuldadeAssim, embora a tecnologia NTA-FL e os algoritmos de otimização possam melhorar a precisão da distribuição de tamanho de partícula e da análise de concentração,Gargalos técnicos da NTA não foram superadosOtimização de algoritmos e métodos de marcação fluorescenteObter os resultados corretos com base no erroAinda é preciso ter cuidado para não confiar excessivamente nos dados obtidos com esta tecnologia.NanoCoulter nanométrico de partículasPrincípio de KurtQuebra os limites do princípio óptico, pode analisar com precisão cada partícula porosa, alcançar a detecção de partículas individuais no sentido real, para a distribuição de tamanho de partículas mais amplaSistema de dispersãoAs amostras têm melhores resultados de medição. E não é afetado pelas propriedades ópticas da amostra, como a refração, a absorção de luz, os dados não se encaixam, o estado da amostra de reação mais real.
